本發(fā)明專利技術公開了一種融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次包含信號肽、IgG1的Fc段和NKp80的胞外結構域NKp80ED，本發(fā)明專利技術還公開了所述融合蛋白的制備方法及其在提高NK細胞的殺傷活性、抑制腫瘤的生長等方面的用途。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及腫瘤免疫學領域，主要涉及能在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用的活性 蛋白及其制備和用途。具體而言，本專利技術涉及人源NKp80-Fc融合蛋白及其制備方法和在腫 瘤治療中的應用。
技術介紹
自然殺傷細胞（NK細胞）是重要的天然免疫細胞，能通過釋放殺傷性顆粒以及細 胞因子殺傷腫瘤細胞。NK細胞缺陷會導致免疫監(jiān)視功能缺失，進而促進腫瘤的發(fā)生及逃逸。 NK細胞識別并且靶向殺傷腫瘤細胞依賴于NK細胞表面的活化性受體。NK細胞的活化性受 體可以與腫瘤細胞上的配體識別，進而活化NK細胞，殺傷腫瘤細胞。NK細胞表面的活化性 受體包括⑶16, 2B4, NKG2D，⑶226以及自然殺傷性受體（包括NKp30、NKp44和NKp46等）。 近來的研宄表明NKp80也是一種重要的NK細胞活化性受體，幾乎表達于所有NK細胞表面， 與其配體AICL(activation_induced C-type lectin，活化誘導的C型凝集素）結合后能迅 速活化NK細胞，殺傷腫瘤。 AICL作為NKp80目前為止唯一的特異性配體，其主要表達于惡變的造血細胞上， 尤其是惡性的骨髓細胞，比如急性骨髓性白血病（AML)和慢性骨髓性白血病（CML)細胞，此 外還表達于惡性上皮腫瘤細胞和黑色素瘤細胞。研宄表明AICL的表達腫瘤細胞對NKp80 陽性的NK細胞敏感，因而NKp80-AICL的識別將成為一個重要的免疫治療靶點。 長期以來，單克隆抗體已被廣泛的應用于腫瘤治療，例如，利妥昔單抗與赫賽汀都 取得了較好的治療效果。這些單克隆抗體都是識別腫瘤細胞的特異性分子，進而通過活化 補體導致腫瘤被殺傷。此外，部分人源化抗體還可以與NK細胞上的CD16分子作用，通過抗 體介導的細胞毒作用（ADCC)來殺傷腫瘤細胞。但遺憾的是，在許多白血病的治療中，并未 開發(fā)出有效的治療性抗體。鑒于AICL選擇性表達于惡變的造血細胞上，尤其是惡性的骨 髓細胞上，而且目前尚沒有靶向AICL分子的治療性抗體。所以，我們制備了能夠靶向AICL 的NKp80-Fc融合蛋白，該蛋白利用腫瘤細胞高表達的AICL分子作為靶點，通過NK細胞的 ADCC作用來殺傷腫瘤細胞，為腫瘤的免疫治療提供了新的思路。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供一種融合蛋白NKp80_Fc〇 本專利技術提供一種基于NKp80_Fc的腫瘤治療方法 本專利技術的目的在于提供一種NKp80_Fc融合蛋白，具體而言，能靶向腫瘤細胞表面 AICL分子從而殺傷腫瘤細胞的融合蛋白。 本專利技術的又一個目的是提供本專利技術的NKp80_Fc融合蛋白的制備方法。 本專利技術的又一個目的是提供本專利技術NKp80_Fc融合蛋白在NK細胞的腫瘤免疫治療 中的應用。 本專利技術的融合蛋白能與腫瘤細胞表面的AICL配體特異性結合，其可以用人工合 成方法合成，也可以將所述融合蛋白的重組基因片段插入到真核表達載體中，然后用所述 重組載體轉染宿主細胞，并進行培養(yǎng)、表達和純化，從而用基因工程方法生產(chǎn)。 上述的腫瘤細胞指的是各種人來源的AICL陽性的腫瘤細胞，例如，但不限于各種 惡性骨髓性的細胞如急性骨髓性白血病以及慢性骨髓性白血病細胞等。 本專利技術提供活性成分是上述NKpSO-Fc融合蛋白的抑制腫瘤細胞生長的藥物。 上述藥物可包括一種或多種藥學上可接受的載體。 上述載體可以是稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表 面活性劑、吸附載體和/或潤滑劑。 上述藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備出以下劑型：注射液和凍干粉針。 由于AICL選擇性高表達于多種腫瘤細胞，特別是惡性的骨髓細胞，而且目前尚沒 有可利用的靶向AICL分子的治療性抗體，本專利技術將能夠提供一種能夠靶向AICL分子的治 療性融合蛋白，并且這一融合蛋白能夠在腫瘤免疫治療中起到顯著作用。 本專利技術的融合蛋白均以正常人體中的蛋白為模板設計，對人體幾乎沒有副作用。 本專利技術的蛋白可采用現(xiàn)有的常規(guī)方法制備，技術成熟。這些都是本專利技術相對于現(xiàn) 有技術的有益技術效果。 更具體地，本專利技術提供以下各項： 1.融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次包含信號肽、IgGl的Fc段和NKp80 的胞外結構域NKp80ED。 2.根據(jù)1所述的融合蛋白，其中所述NKp80ED的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 3.根據(jù)1所述的融合蛋白，其中所述IgGl的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。 4.根據(jù)1所述的融合蛋白，其中所述信號肽是IL-2分子的信號肽，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO:5 所示。 5.根據(jù)1所述的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示。 6.核酸，所述核酸編碼根據(jù)1-5中任一項所述的融合蛋白，所述核酸具有例如如 SEQ ID N0:8所示的核酸序列。 7.載體，所述載體包含根據(jù)6所述的核酸。 8.根據(jù)1-5中任一項所述的融合蛋白、根據(jù)6所述的核酸和根據(jù)7所述的載體在 制備藥物中的用途，所述藥物用于提高NK細胞殺傷腫瘤細胞的能力。 9.根據(jù)8所述的用途，其中所述腫瘤細胞是AICL陽性腫瘤細胞，例如白血病細胞。 10.藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)1-5中任一項所述的融合蛋白和藥用 載體。【附圖說明】 圖1，NKp80-Fc在單克隆細胞株細胞培養(yǎng)上清中的表達。 圖2, NKp80-Fc能特異性結合腫瘤細胞表面的AICL配體。 圖3, NKp80-Fc能有效促進NK細胞與腫瘤細胞的結合。 圖4, NKp80-Fc能促進NK細胞對腫瘤細胞的殺傷功能。 圖5, NKp80-Fc能抑制腫瘤細胞的生長。【具體實施方式】 以下通過實施例來進一步闡明本專利技術。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明 的目的，并不意欲限制本專利技術的范圍和精神。 實施例中的實驗方法，如無特別說明，均采用本領域常規(guī)技術，實驗試劑均為市售 產(chǎn)品。 實施例所用儀器如下：移液器購自法國Gilson公司，超凈工作臺購自上海智城 儀器公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司，離心機購自德國Hettich公司， PCR儀購自Biometra公司，蛋白核酸檢測儀購自上海瀘西分析儀器廠，熒光顯微鏡購自 Olympus公司，流式細胞儀購自BD公司，γ射線計數(shù)器購自中科大中佳公司。 實施例1、NKp80_Fc融合蛋白的制備 I. NKp80_Fc融合蛋白的設計 NKp80是一個二型跨膜糖蛋白，其胞外端包含有一個C型凝集素結構域（C-Type Lectin Domain, CTLD)，與NKG2D同屬于NKC編碼的活化性C型凝集素樣受體家族。其蛋白 序列包含232個氨基酸，分子量為26, 666Da，其中胞內(nèi)段包含從l-38aa共38個氨基酸，跨 膜段包含從39-59aa共21個氨基酸，胞外端則包含從60-232aa共173個氨基酸。其中胞 外端從121-231aa共111個氨基酸是一段C型凝集素結構域（CTLD)，這段結構域包含了 C 型凝集素受體共有的六個保守的半胱氨酸殘基。 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的NKp80的基因數(shù)據(jù)，我們得到NKp80全基因的編碼序列 (參考NCBI Reference Sequence :CCDS41750.1)。基于NKp80的二級結構以及功能域的分 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次包含信號肽、IgG1的Fc段和NKp80的胞外結構域NKp80ED。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：田志剛，鄧剛，孫汭，鄭曉東，周靜，魏海明，
申請(專利權)人：中國科學技術大學，
類型：發(fā)明
國別省市：安徽;34
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