本發(fā)明專利技術(shù)提供一種檢測雞體抗病毒蛋白的試劑盒及應(yīng)用，用于雞IFIT5，PKR和OASL基因轉(zhuǎn)錄水平的SYBR?Green?I熒光定量。本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒及檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性濃度范圍廣、重復(fù)性好、操作簡便及省時，可用于多種樣品類型雞體抗病毒蛋白的絕對或相對定量檢測。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及獸醫(yī)生物
的檢測方法，特別涉及檢測雞體抗病毒蛋白的熒光 定量PCR試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
當(dāng)受到病毒感染時，病原相關(guān)的分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP)被雞體細(xì)胞的模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRR) 所識別。PRR激活相應(yīng)配體，啟動雞體固有免疫通路的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素 (Interferon, IFN)和促炎性細(xì)胞因子（pro-inflammatory cytokines)。干擾素進(jìn)而刺激 干擾素誘導(dǎo)基因（IFN-stimulated genes, ISGs)的表達(dá)，產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，發(fā)揮抗感染 的效應(yīng)。 ISG表達(dá)的蛋白中，有3種蛋白在多種病毒感染中發(fā)揮著重要的拮抗作用，分別介 紹如下。 (I)IFIT ISGs可以表達(dá)一類三角形四鈦重復(fù)段蛋白（IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats, IFIT)家族，也稱為 ISG56 家族。該家族有 IFIT1、IFIT2、 IFIT3和IFIT54個成員，成簇定位在同一染色體上。各成員均有2個外顯子和1個內(nèi)含子。 在干擾素或病毒等的刺激下，IFIT基因高效表達(dá)，產(chǎn)生的蛋白可作用于病毒的復(fù)制以及I 型干擾素的反饋調(diào)節(jié)，在雞體抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用。 (2) PKR PKR的全稱為雙鏈RNA(dsRNA)激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Double-Stranded RNA dependent protein kinase)。PKR在雞體正常生理狀態(tài)下表達(dá)量少。在受到IFN或病 毒復(fù)制中產(chǎn)生的dsRNA的刺激時，PKR被激活而發(fā)生自體磷酸化，抑制病毒相關(guān)基因的翻譯 和轉(zhuǎn)錄。 (3) OASL 0ASL，即寡腺苷酸合成酶基因家族樣蛋白（2'，5' -oligoadenylate synthetase-like protein)。在IFN或病毒dsRNA的刺激作用下，OASL被激活，進(jìn)而降解 細(xì)胞和病毒的RNA，抑制病毒相關(guān)蛋白分子的合成，從而發(fā)揮其抗病毒感染的作用。因 OASL 主要在細(xì)胞漿中發(fā)揮作用，因此其在具有胞漿復(fù)制特性的病毒的感染中發(fā)揮重要作用。 檢測病毒感染或疫苗免疫雞體抗病毒物質(zhì)的表達(dá)水平，對于深入了解病毒的致病 機(jī)制，研宄開發(fā)雞用新型疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及抗病毒藥物，均具有非常重要的意義。熒光 定量PCR方法具有敏感、快速、實時和所需檢測樣品少等優(yōu)點(diǎn)。如果能夠開發(fā)出商品化的熒 光定量PCR系列試劑盒，用于雞體抗病毒效應(yīng)分子的標(biāo)準(zhǔn)化檢測，將為相關(guān)的科學(xué)研宄和 臨床應(yīng)用帶來極大的便利。 目前尚無商品化的檢測雞體抗病毒蛋白IFIT5, PKR或OASL的試劑盒。熒光定量 PCR檢測這些蛋白的技術(shù)，僅被部分研宄型實驗室所掌握。而且各實驗室所采用的引物、反 應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)各不相同，導(dǎo)致了實驗結(jié)果間的不可比性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在提供一種檢測雞體抗病毒蛋白IFIT5, PKR和OASL基因轉(zhuǎn)錄水平的 SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒及其應(yīng)用。本專利技術(shù)提供的檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、 線性濃度范圍廣、重復(fù)性好、操作簡便及省時，可用于多種樣品類型中雞IFIT5，PKR和OASL 的絕對或相對定量檢測。 為了實現(xiàn)該目的，本專利技術(shù)設(shè)計和篩選了三對特異性引物，從新城疫病毒感染的雞 胚尿囊液中分別擴(kuò)增出雞IFIT5，PKR和OASL基因片段。然后，分別制備了這三個基因的質(zhì) 粒標(biāo)準(zhǔn)品，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)選和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。通過實際樣品的檢測應(yīng) 用評估，表明專利技術(shù)所提供的試劑盒可以用作雞正常生理狀態(tài)、疫苗免疫以及病毒感染狀態(tài) 下，多種樣品類型中雞IFIT5, PKR和OASL基因的絕對或相對定量檢測。 本專利技術(shù)具體的技術(shù)方案如下。 1.提供了檢測雞IFIT5，PKR和OASL基因的熒光定量PCR特異性引物。本專利技術(shù)使 用Primer Premier 5. 0設(shè)計特異性PCR引物，經(jīng)過多對引物的篩選、得到擴(kuò)增效率和特異 性好的一對特異性引物。其核苷酸序列分別為： 引物對一： IFIT5 Chicken-U :5'-ATGCCGGCTATGCAATAGC-3' ； IFIT5 Chicken-L :5'-CTTGCATTGAAACTTCA-3' 預(yù)計擴(kuò)增片段大小為151bp。 引物對二： PKR Chicken-U :5'-TCACAGATTATAGGTGT-3' ； PKR Chicken-L :5'-GTTACTCTTTGGTTATAT-3' 預(yù)計擴(kuò)增片段大小為94bp。 引物對三： OASL Chicken-U :5'-ATCATCGAGAGGCGGCTC-3' ； OASL Chicken-L :5'-TCCGCGCTACAAGGACAGC-3' 預(yù)計擴(kuò)增片段大小為81bp。 2.提供了雞IFIT5, PKR和OASL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。將新城疫病毒感染11日齡的SPF雞 胚，在病毒感染24小時后收取雞胚尿囊液，應(yīng)用Trizol法提取其總RNA，然后使用隨機(jī)引物 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別使用上述三對引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增雞IFIT5, PKR和OASL的基因 片段。目的長度的擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，與PUC57載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 選擇疑似陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果分別與雞IFIT5，PKR和OASL的基因序列（GenBank Accession No.分別為：XM_421662，NM_204487和NM_205041)進(jìn)行比對。測序正確的質(zhì)粒 分別命名為 pUC57-TLR3Ch，pUC57-TLR7Ch 和 pUC57-MDA5Ch。 3.本專利技術(shù)提供的檢測雞IFIT5, PKR和OASL的試劑盒，分別包括相應(yīng)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 品（陽性模板對照），濃度為10 μ M的上游引物溶液，濃度為10 μ M的下游引物溶液，2 X熒 光定量PCR預(yù)混液（Master Mix)和熒光定量PCR緩沖液（Buffer)。 4.本專利技術(shù)可以用于檢測多種類型的樣品中雞IFIT5，PKR和OASL的基因轉(zhuǎn)錄水平。 樣品類型包括但不限于：雞抗凝全血、雞脾臟淋巴細(xì)胞、雞外周血淋巴細(xì)胞、雞血清以及雞 胚尿囊液等。 5.本專利技術(shù)提供的檢測雞IFIT5，PKR和OASL的熒光定量PCR方法，包括以下步驟， a.待檢樣品cDNA的制備： 首先根據(jù)待檢樣品的種類（如：雞抗凝全血、雞脾臟淋巴細(xì)胞、雞外周血淋巴細(xì) 胞、雞血清以及雞胚尿囊液），提取樣品RNA。然后，使用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備樣 品的cDNA。 b.配制PCR反應(yīng)體系： PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體系均為20 μ 1，包括：2X熒光定量PCR預(yù)混液10 μ 1，10 μΜ上游 引物1 μ 1，10 μ M下游引物1 μ 1，熒光定量PCR緩沖液2 μ 1，DNA模板2 μ 1和CldH2O 4 μ 1。 c.設(shè)定PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序為： 95°C預(yù)變性2. 5分鐘；95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒擴(kuò)增45個循環(huán)，每個循環(huán) 結(jié)束時檢測熒光；熔解曲線分析為95°C 15秒，60°C 50秒本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測雞體抗病毒蛋白的試劑盒，其特征在于，包括三對特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列分別為：引物對一：IFIT5Chicken?U：5'?ATGCCGGCTATGCAATAGC?3'；IFIT5Chicken?L：5'?CTTGCATTGAAACTTCA?3'引物對二：PKR?Chicken?U：5'?TCACAGATTATAGGTGT?3'；PKR?Chicken?L：5'?GTTACTCTTTGGTTATAT?3'引物對三：OASL?Chicken?U：5'?ATCATCGAGAGGCGGCTC?3'；OASL?Chicken?L：5'?TCCGCGCTACAAGGACAGC?3'。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃艷艷，許傳田，吳家強(qiáng)，楊少華，黃慶華，張琳，朱曼玲，高丹丹，
申請(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37
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