本發(fā)明專利技術(shù)涉及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種C型凝集素(C-type?lectin)及其制備和應(yīng)用。C型凝集素為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。制備方法：以許氏平鮋cDNA為模板PCR擴(kuò)增C型凝集素基因，構(gòu)建質(zhì)粒pLecC；將pLecC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Transetta(DE3)，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，收集上清，濃縮后即得重組C型凝集素。所述C型凝集素對多種弧菌具高效凝集作用，經(jīng)C型凝集素處理后的細(xì)菌對許氏平鮋的侵染能力顯著降低。因此，該C型凝集素有望應(yīng)用于魚類細(xì)菌性病害的防治。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)及分子生物學(xué)及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種C型凝集素 (C-type lectin)編碼基因及其蛋白制備和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
凝集素是一種糖結(jié)合蛋白，廣泛存在于微生物和動植物中。C型凝集素是凝集素 家族的重要成員，所有的膠原凝素和選擇素均屬C型凝集素，存在于大多數(shù)動物體內(nèi)。該類 凝集素的主要特征在于他們均含有一個共同的糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohy化ate-recognition domain,CRD)。作為一類重要的模式識別受體，C型凝集素可W和微生物表面特定糖分子結(jié) 合發(fā)揮凝集作用，在宿主對抗微生物侵染的天然免疫中發(fā)揮著重要作用。此外，C型凝集 素和病原反應(yīng)后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)，包括增強(qiáng)吞瞻作用，趨化作用，刺激 活性氧的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的釋放，部分C型凝集素還可參與樹突細(xì)胞介導(dǎo)的抗原遞呈和吸 收。因此，C型凝集素可在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用作免疫調(diào)節(jié)劑或病害防治藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供一種C型凝集素編碼基因及其蛋白制備和應(yīng)用。【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對本專利技術(shù)進(jìn)行舉例描述，而 非W任何形式對本專利技術(shù)進(jìn)行限制。 實(shí)施例1 本專利技術(shù)的C型凝集素蛋白為序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列，其編碼基因為序列 表SEQ ID No. 2中的堿基序列 序列表SEQ ID No. 1為； ADCPEGEASSLKLQL化LRNRF畑LCDQYSNLATNCSAPVIPCAQCPEGWLVVGDQC化LTTD畑DYSNST NKCAEIGAHLAILTTKEQ皿AV邸EGKNIGGIYTYYWIGLTDIETEGDWRWVDNSKLRTPFWEAPEPNNHLSGGPE GEDCAVVQSYTQLWHDVPCSFTYPRICQMDAILPQ (a)序列特征： ?長度；182?類型：氨基酸序列 ?鏈型：單鏈 ?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；線性 化）分子類型謹(jǐn)白質(zhì) (C)假設(shè)杏 (d) 反義杏 (e) 最初來源：許氏平觸 (f)結(jié)構(gòu)特征；該蛋白預(yù)期含有一個CRD結(jié)構(gòu)域（由氨基酸46-175組成）。序列表SEQIDNo. 2 為；(a)序列特征： ?長度；576 ?類型：堿基序列 化）分子類型基因 (C)假設(shè)杏 (d) 反義杏 (e) 最初來源：許氏平觸 實(shí)施例2 C型凝集素的制備方法： (1)質(zhì)粒pLecC的構(gòu)建； 對C型凝集素編碼基因?qū)?yīng)的氨基酸序列進(jìn)行分析，W去除編碼信號膚和終止密碼 的基因序列為模板設(shè)計正向引物L(fēng)ecCFl和反向引物L(fēng)ecCRl。W許氏平觸cDNA為模板， 用引物L(fēng)ecCFl和LecCRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為；94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后 94°C40s, 54°C60s, 72°C40s, 5 個循環(huán)后改為 94°C40s,6TC60s, 72°C40s, 25 個循環(huán)后再 在72°C延伸反應(yīng)7min。PCR產(chǎn)物純化后與載體祀as廠T1 (購于"全式金（北京）生物技 術(shù)有限公司"）于室溫連接10分鐘，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在含氨節(jié)青霉素（100yg/ ml)、Xgal(40yg/ml)、異丙基-0 -D-硫代半乳糖巧（24yg/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 -24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pTlLecC。 將上述質(zhì)粒pTlLecC和質(zhì)粒祀T259(質(zhì)粒祀T259構(gòu)建過程參見化engWJ，化 YH,SunL.Cloningandanalysisofaferritinsubunitfromturbot(Scophthalmus maximus).FishShellfishImmunol.2010a;28 巧- 6),829 - 836.)分別用限制性內(nèi)切酶 EcoRV和Swal酶切后回收0. 58化和5. 4化片段，將該二個片段用T4DNA連接酶連接，連接 液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，在含卡那霉素（50yg/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時，篩選轉(zhuǎn) 化子提取質(zhì)粒，即為pLecC。所述LecCFl為 5 ' -gatatcCTCATCGGCTTGTTGGC-3'；LecCRl為 5> -gatatcCTGGGGCAGGATGGC-3>。 (2) C型凝集素的表達(dá)和制備： 將步驟（1)的質(zhì)粒pLecC轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21Transetta〇)E3)(購于"全式金（北京） 生物技術(shù)有限公司"），在含50yg/ml的卡那霉素和50yg/ml的氯霉素的LB培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子即為化21/pLecC。將化21/pLecC于含有卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基 中于37°C培養(yǎng)至孤e。。為0.6,加入ImM的異丙基-0 -D-硫代半乳糖巧，37°C繼續(xù)振蕩培 養(yǎng) 4-5 小時，而后用GEHealthcare(美國）公司的nickel-nitrilotriaceticacid親和 層析柱純化重組蛋白。將純化的重組蛋白進(jìn)行N-端氨基酸測序，證實(shí)其分別為序列表SEQ IDNo. 1中氨基酸序列所示的C型凝集素。 (3)C型凝集素對細(xì)菌的凝集活性 創(chuàng)傷弧菌和魚腸道弧菌制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌和魚腸道弧菌分別至 0D600為0. 5,然后室溫離屯、10分鐘，收集菌體，將其懸浮于TBS-化化緩沖液巧OmM Tris-Cl,lOOmM化Cl,lOmMCaC12，pH7. 5)中至終濃度為 2xl09cfu/ml。 凝集素LecC的凝集活性。將10y1上述菌液與等量的LecC巧00yg/mU或？85 (對 照）混合，25°C保溫1小時。隨后將混合液滴于載玻片上，于顯微鏡下觀察。觀察結(jié)果顯示 重組C型凝集素對于創(chuàng)傷弧菌和魚腸道弧菌有較強(qiáng)的凝集效果。 (4) C型凝集素在病害防治中的應(yīng)用 將10條大菱解（每條重約lOg)隨機(jī)分為2組，每組5條。將該2組分別命名為A和B組。將3)中制備的創(chuàng)傷弧菌在TBS-化化緩沖液中重懸至2xl06c化/ml,取50 y 1菌懸液， 加入50 y 1重組C型凝集素至終濃度為500 y g/ml或PBS(對照），25°C保溫比。隨后將A 組的每條魚腹腔注射100 LecC和創(chuàng)傷弧菌的混合液。將B組（對照組）的每條魚腹腔 注射100 y 1 PBS和創(chuàng)傷弧菌的混合液。12小時后將A和B組魚麻醉后取肝臟組織，稱重 后勻漿，將勻漿液涂布于LB固體平板，28°C培養(yǎng)32 - 48小時。菌落計數(shù)發(fā)現(xiàn)，與PBS組相 比，重組C型凝集素處理導(dǎo)致創(chuàng)傷弧菌對許氏平觸的侵染能力降低93. 5%。因此，該C型凝 集素可望應(yīng)用于魚類細(xì)菌性病害的防治。[001引表一、LecC對創(chuàng)傷弧菌侵染能力的影響（X104CFU/g)【主權(quán)項】1. 一種C型凝集素蛋白，其特征在于，C型凝集素蛋白為序列表SEQ ID No. 1中的氨基 酸序列所示。2. 權(quán)利要求1所述C型凝集素蛋白的編碼基因，其特征在于，所述C型凝集素蛋白編碼 基因的DNA序列如SEQ ID No. 2所示。3. -種權(quán)利要求1所述C型凝集素蛋白的制備，其特征在于 (1) 質(zhì)粒pLecC的構(gòu)建 以許氏平觸cDNA為模板，用引物L(fēng)ecCFl和LecCRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與 載體pEasy-Tl構(gòu)建成質(zhì)粒pTILecC，將pTILecC本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種C型凝集素蛋白，其特征在于，C型凝集素蛋白為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張敏，岳斌，趙鑫鵬，
申請(專利權(quán))人：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37
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