本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因A3型突變的引物組及應(yīng)用，屬于植物分子標記開發(fā)和作物分子輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)所提供的引物組的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.4所示。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了利用引物進行A3突變型檢測的方法，該方法是以待測樣品的DNA為模板，以如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.2所述序列為引物進行第一輪PCR擴增，稀釋擴增產(chǎn)物后，再以稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，以如SEQ?ID?NO.3-SEQ?ID?NO.4所述序列為引物進行第二輪PCR擴增，最后利用高分辨率熔解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物進行基因型突變檢測。本發(fā)明專利技術(shù)可以大大縮短高油酸大豆材料的篩選周期，為高油酸大豆品種的培育提供了分子標記資源。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)及一種用于檢測大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變的引物組及應(yīng) 用，屬于植物分子標記開發(fā)和作物分子輔助選擇
技術(shù)介紹
大豆為人類提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的經(jīng)濟性狀。 商品大豆油主要包括大約11 %的軟脂酸（16:0) ,4%的硬脂酸（18:0) ,25%的油酸（18:1)， 52%的亞油酸（18:2)和4%的亞麻酸（18:3HFe虹，2007)。中國各地區(qū)的氣候、±壤、水質(zhì) 等自然條件W及品種選育方向均存在差異，為大豆種質(zhì)資源品質(zhì)特性的豐富變異創(chuàng)造了條 件，有利于篩選優(yōu)異脂肪酸組成的大豆種質(zhì)（蓋均銳等，2001)。不飽和脂肪酸為人體必需 脂肪酸，在人體新陳代謝中具 有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中總膽固醇和有害膽固醇含量，營養(yǎng)學 家稱之為"安全脂肪酸"，亞油酸具有抑制癌癥，預防糖尿病和減少體內(nèi)脂肪，減少血液中膽 固醇量，防止動脈硬化的作用，亞麻酸具有溶血栓，降血壓防血小板凝集，健腦抗衰老等作 用（陳學珍，2004)。在大豆油脂中的不飽和脂肪酸具有重要的生理保健作用，不飽和脂肪 酸中油酸的穩(wěn)定性最好，提高其含量可W延長貶藏期，但由于亞油酸和亞麻酸分別含有2， 3個不飽和雙鍵，容易使油脂氧化變質(zhì)，造成豆油及其食品味道不佳，營養(yǎng)價值降低。另外， 由于飽和脂肪酸能量低，不易消化吸收，過多食用會導致肥胖病和屯、血管疾?。盍?， 2006)。因此，提高油酸含量，降低亞油酸含量是大豆品質(zhì)育種的重要目標之一。 在油脂的合成途徑中，脂肪酸脫氨酶2 (FAD2)在油酸前體向亞油酸前體的轉(zhuǎn)變過 程中起到了至關(guān)重要的作用（Okul巧等，1994 ;Schlueter等，2007)，在發(fā)育的大豆種子中， 2 個脂肪酸脫飽和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表達水平 最高，因此該2個基因被認為是控制大豆油酸含量的候選基因，并且越來越多的研究者通 過改造該2個目標基因來培育高油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆品種?；蚬こ毯秃蜻x基因分子育種 策略被用來培育高于80%油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆炬U虹等，2002出oshino等，2010 ;化am等， 2010)，該些研究成果證明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突變程度越嚴重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同時油脂的穩(wěn)定性也越強。 我國作為大豆的發(fā)源地，具有豐富的大豆種質(zhì)資源。目前，我國作物種質(zhì)資源庫己 保存的大豆種質(zhì)資源達3萬余份，居世界之首（汪越勝，2002)。然而利用傳統(tǒng)的油分鑒定 方法對數(shù)目龐大的大豆資源進行鑒定工作量大，周期長的問題，目前尚沒有一種能夠快速 并且準確地檢測控制大豆高油酸含量的A3型突變位點的方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為解決上述問題，本專利技術(shù)提供了一種大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變位點 的快速檢測方法，所采取的技術(shù)方案如下： 本專利技術(shù)的一個目的在于提供一種用于檢測大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變 的引物組，該引物組的核巧酸序列如SEQIDNO. 1-4所示。[000引本專利技術(shù)的另一個目的在于提供一種利用所述引物組檢測大豆脂肪酸脫氨酶合成 基因A3型突變的方法，該方法是W待測樣品的DNA為模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2 所述序列為引物進行第一輪PCR擴增，稀釋擴增產(chǎn)物后，再W稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，W 如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述序列為引物進行第二輪PCR擴增，最后利用高分辨率烙 解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物進行基因型突變檢測。 所述方法的步驟如下： 1)提取待鑒定材料的DNA;[001U2)W步驟1)所得的DNA為模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引物 進行第一輪PCR巢式擴增，獲得擴增產(chǎn)物后，進行稀釋處理；[001引如W步驟。中稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，W如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述序 列為引物進行第二輪巢式PCR擴增，擴增結(jié)束后獲得第二輪擴增產(chǎn)物； 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率烙解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物的基因型突變進行檢測。 優(yōu)選地，步驟2)所述第一輪巢式PCR處理，PCR擴增條件為；94°C預變性4min， 94°C變性40s，6rC退火30s，72°C延伸15s，共35個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述 稀釋處理，是利用d地2〇稀釋10倍。 優(yōu)選地，步驟3)所述第二輪巢式PCR處理，PCR擴增條件為；94°C預變性4min， 94°C變性40s，59°C退火30s，72°C延伸10s，共15個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫。 優(yōu)選地，步驟4)所述利用高分辨率烙解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物的基因 型突變進行檢測，是根據(jù)目標片段的GC含量的變化在不同烙解溫度出現(xiàn)吸收峰的位置判 定，突變株的GC含量下降，溶解溫度降低，吸收峰在左側(cè)；野生型GC含量高，烙解溫度高，吸 收峰在右側(cè)；雜合型的GC含量居中，吸收峰位于中間溫度。 所述方法的具體步驟如下：1)提取待鑒定材料的DNA; 。W步驟1)所得的DNA為模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引 物進行第一輪？〔3擴增，？0?擴增條件為；941：預變性4111111，941：變性4〇3,611：退火3〇3， 72°C延伸15s，共35個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，獲得擴增產(chǎn)物后，利用d地20稀釋 10倍； 3)W步驟2)中稀釋后的擴增產(chǎn)物為模板，W如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述 序列為引物進行第二輪PCR擴增，PCR擴增條件為；94°C預變性4min，94°C變性40s，59°C退 火30s，72°C延伸10s，共15個循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，擴增結(jié)束后獲得第二輪擴 增產(chǎn)物. 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率烙解曲線分析儀器對第二輪擴增產(chǎn)物的基因型突變進行檢測，并將所得烙解曲線與野 生型和雜合型樣品的烙解曲線進行對比，當待測樣品的烙解溫度降低，烙解曲線位于野生 型和雜合型樣品的左側(cè)時，該待測樣品即為A3型突變株。 所述任一方法用于大豆的遺傳育種。 利用所述引物組制備的檢測試劑盒。 所述試劑盒用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氨酶合成基因A3型突變體。 本專利技術(shù)有益效果： 本專利技術(shù)是在克隆出的大豆脂肪酸脫氨酶合成基因GmFAD2-lA基礎(chǔ)上，通過比較高 油酸大豆A3和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lA基因序列，首次發(fā)現(xiàn)了位于76化P處的 單堿基突變佑一A)，且該突變導致油酸含量變化。 本專利技術(shù)針對A3突變位點設(shè)計了 2套分子標記（外部引物和內(nèi)部引物，引物如序列 表所示）進行巢式PCRW確保擴增的特異性，并利用高分辨率烙解曲線分析儀器進行突變 位點檢測。本專利技術(shù)開發(fā)的分子標記的使用方法為；首先利用外部引物進行第一輪PCR擴增， 隨后將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作模板，且W內(nèi)部引物進行第二輪PCR擴增，最后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn) 移至高分辨率烙解曲線分析儀器中進行基因型突變檢測。該突變位點的分子標記開發(fā)對于 高油酸大豆的分本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用于檢測大豆脂肪酸脫氫酶合成基因A3型突變的引物組，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1?SEQ?ID?NO.4所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：任航，南海洋，張倩，
申請(專利權(quán))人：黑龍江富航農(nóng)業(yè)科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：黑龍江;23
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