一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應用技術

本發明專利技術提供一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應用，該鉻-高密度脂蛋白螯合物是鉻離子與高密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成，可用于制備檢測人體鉻-高密度脂蛋白螯合物的試劑。本發明專利技術首次證實了鉻離子可直接作用于高密度脂蛋白。本發明專利技術建立了鉻-高密度脂蛋白螯合物的定性定量檢測方法，以檢測一個地區人群體內高密度脂蛋白的含量，從而間接反映一個地區鉻污染程度以及對人群的健康影響。本發明專利技術建立的鉻-高密度脂蛋白螯合物定量檢測方法準確度高重、復性好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及重金屬離子的免疫學檢測，具體涉及一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及 其制備方法與應用。
技術介紹
脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質與脂質結合所形成的一種脂質-蛋白質復 合物，按密度分為高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，簡稱HDL)、中間密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein，簡稱IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，簡稱LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,簡稱VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron，CM)。血液中大約百分之三十的膽固醇是通過高密度脂蛋白從組 織細胞中運輸到肝臟轉化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。高密度脂蛋白由50%的蛋白、 30%的磷脂、25%的膽固醇（其中70%為膽固醇酯）、5%的三酰甘油組成。高密度脂蛋白（簡稱HDL)是血漿中主要脂蛋白之一，其密度最高，顆粒直徑最小， 蛋白和脂質含量大致均等的異質性脂蛋白。由50%的蛋白、30%的磷脂、25%的膽固醇（其 中70%為膽固醇酯）、5%的三酰甘油組成。HDL是動脈粥樣硬化發生和發展的主要脂類保護因素，其在血清蛋白中有很強的 抑制動脈粥樣硬化作用，是冠狀動脈疾病的重要保護因子，與冠心病危險程度呈負相關。 但是，研究表明高密度脂蛋白膽固醇的數量并不能與心血管疾病的保護程度成正 比，因為其中已經發生結構改變的高密度脂蛋白仍然可以測量到但已經喪失正常功能甚至 會加重動脈粥樣硬化的進展。而高密度脂蛋白膽固醇的數量下降則可顯著提示動脈粥樣硬 化的保護性減弱，因而檢測定量血清中HDL對于冠心病具有重要意義，不僅可以用于早期 識別動脈粥樣硬化的危險性，而且可以作為脂類調節藥物治療過程的檢測以及預后評價的 指標之一。 絡（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，其質地堅硬，表面具有 光澤，有較高的熔點，在工業生產中具有重大的經濟價值，一個世紀以來被廣泛應用，每年 全球鉻生產量高達107噸，因而鉻是一種名副其實的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個方面，與人們的生活息息相關，但是同樣也對人 類的身體健康產生巨大影響。自然界中鉻主要以三價和六價的形式存在，而一般認為，三價鉻是人類所需的微 量元素，而六價鉻才是明顯的毒性物質。由于六價鉻易通過細胞膜進入細胞，而且可以通過 一系列反應，產生強烈的細胞毒性及基因毒性，因而普遍認為六價鉻的毒性高于三價鉻，達 10 -100倍。學者認為當水中的六價鉻含量超過0.05mg/L即是有毒的。六價鉻可以通過皮 膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進入人體，對于職業性暴露人群主要是 通過呼吸道吸入六價鉻灰塵，而對于普通人群則是通過飲入污染水源、食入被污染的食物、 吸入等方式攝入六價鉻。六價鉻進入體內后，可以引發氧化應激、顯色體畸變、細胞凋亡、多 種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質交聯、DNA-氨基酸交聯、Cr-DNA配合物形成等）， 從而造成機體多處組織、器官、系統損傷。 如前所述，鉻與多種蛋白質之間關系密切，可以與多種蛋白質結合，抑制多種蛋白 酶的活性。隨著對鉻毒性研究的深入，人們逐漸認識到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過程 中扮演著重要的角色，被認為是了解鉻的毒性機理的關鍵所在，因此，對鉻和蛋白質相互作 用的研究就顯得愈發重要。而現在關于鉻與蛋白質作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋 白質與鉻之間的關系還不清楚，因而加強對于鉻與蛋白質之間的關系至關重要。 關于鉻中毒，特別是慢性鉻中毒的評價，通過檢測血鉻含量也不能準確評價人體 內的循環鉻含量，無法進一步評估鉻對于機體功能的損傷程度，而隨著科學技術的飛速發 展，鉻與人體的關系也日益緊密，因而尋找一種可以從免疫功能角度評價鉻中毒，特別是慢 性鉻中毒對于機體的損害程度的評價方式日益重要。
技術實現思路
針對鉻污染嚴重的問題，本專利技術的目的在于提供一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及 其制備方法，并建立鉻-高密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鉻-高 密度脂蛋白螯合物在評價一個地區鉻污染程度的應用。通過定量檢測一個地區人群血清中 鉻-高密度脂蛋白螯合物，可以間接反映這個地區人群受鉻污染的情況，從而間接反映這 個地區鉻污染程度。 本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種鉻-高密度脂蛋白螯合 物，該鉻-高密度脂蛋白螯合物是鉻離子與高密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯 合而成。 本專利技術還提供一種上述的鉻-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，即體外合成法， 包括以下步驟： A)鉻-高密度脂蛋白的合成：在提純源于人體的高密度脂蛋白或按照生物學方法 重組的高密度脂蛋白中加入鉻離子進行螯合反應，得到反應溶液； B)鉻-高密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應溶液中 未反應的高密度脂蛋白、特異性抗體和鉻離子，即得鉻-高密度脂蛋白螯合物。 作為優選，所述步驟B)中具體包括以下步驟： (1)溶解樣品：將上述步驟A)的鉻-高密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中，得 鉻-高密度脂蛋白螯合物溶液； (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與高密 度脂蛋白特異性結合的填料，裝柱后，繼續使用稀釋緩沖液平衡層析柱； 所述能與高密度脂蛋白特異性結合的填料為吸附有可與高密度脂蛋白特異性結 合物質的硅膠或樹脂； (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)所述溶液，然后上柱，使高 密度脂蛋白與填料特異性結合； (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 Na2HP0j§液進行洗脫； (5)收集：收集步驟⑷的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原； (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本； (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； 所述能與鉻特異性結合的填料為吸附有可與鉻特異性結合物質的硅膠或樹脂； (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱； (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 Na2HP0j§液進行洗脫； (10)收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原； (11)透析：將步驟（10)的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透 析過夜，收集樣本，即得鉻-高密度脂蛋白螯合物。 作為優選，上述鉻-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，還包括以下對鉻-高密度脂 蛋白螯合物的鑒定步驟，具體包括以下步驟： (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質制備膠床； (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-高密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中； (3)電泳：連接電泳板，進行電泳； (4)檢測：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鉻?高密度脂蛋白螯合物，其特征在于，該鉻?高密度脂蛋白螯合物是鉻離子與高密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張積仁，陽帆，董欣敏，吳婧，蔡睿，孫遙，趙乙木，
申請(專利權)人：上海拜豪生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31