一種檢測17β-雌二醇的方法技術

本發明專利技術一種檢測17β-雌二醇的方法，通過將17β-雌二醇適配體與納米金溶液混合，使得17β-雌二醇適配體包裹在納米金的表面，當體系中存在17β-雌二醇時，包裹在納米金上的適配體會與17β-雌二醇特異性結合，從而釋放出游離的納米金，加入氯化鈉鹽溶液之后，游離的納米金產生聚集，加入羅丹明B，聚集的納米金對羅丹明B熒光沒有淬滅作用；當體系中不存在17β-雌二醇時，加入氯化鈉鹽溶液，納米金則處于分散狀態，加入羅丹明B，分散的納米金則對羅丹明B具有很強的淬滅作用。本實驗通過羅丹明B熒光信號的變化與17β-雌二醇在不同濃度下的線性關系來實現對17β-雌二醇的定量檢測。本檢測方法靈敏度較高、選擇性較好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于材料檢測領域，尤其涉及一種17 P-雌二醇，特別是一種檢測170-雌二醇的方法。
技術介紹
環境內分泌干擾物是指一種外源性物質，這類物質會導致未受損傷的有機體發生逆向健康影響，擾亂內分泌系統，甚至對有機體后代的繁殖系統、身體的生長和發育系統造成巨大的危害。170-雌二醇，是一種活性最強的內分泌干擾物，長期接觸170-雌二醇將會對人體健康產生潛在而不可估量的危害。因此，我們迫切需要開發一種簡單、靈敏、快速的檢測體系實現對17 β-雌二醇的實時檢測。然而，就目前來說，傳統的方法，比如高效液相色譜法，液質聯用，氣質聯用等方法雖早已成熟并準確可靠，但在實際應用中需要昂貴復雜的儀器設備以及訓練有素的技術人員，費力費時，難以滿足大規模應用及實時原位檢測的需要。一些新型的檢測方法，比如電化學法，需要對電極進行修飾，識別能力有所欠缺；而酶聯免疫法則易出現一些假陽性的結果，不能滿足實驗的穩定性。因此，建立高靈敏度、高選擇性的17 P-雌二醇檢測方法具有重要的現實意義。功能核酸適配體，是一類具有特定生物功能的核酸分子序列，通過指數富集配體的系統進化技術(SELEX)篩選而來，它能特異性的識別靶物質。近年來功能核酸已被廣泛應用于生物傳感等分子識別和應用研究領域，并對蛋白質、金屬離子以及小分子等進行檢測。
技術實現思路
針對現有技術中的上述技術問題，本專利技術提供了一種檢測17 P-雌二醇的方法，所述的這種檢測17 P-雌二醇的方法解決了現有技術中檢測17 P-雌二醇的方法存在的機器昂貴、操作復雜、周期較長的缺點以及不穩定性、假陽性等技術問題。本專利技術提供了一種檢測17 P-雌二醇的方法，包括以下步驟: (O 一個制備17 0-雌二醇功能核酸適配體的步驟，所述的功能核酸適配體為一段功能核苷酸序列，所述的功能核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。(2)在一定量適配體溶液中加入納米金溶液，混勻孵育，使得適配體包裹在納米金的表面，再加入待測17 P-雌二醇的水溶液和丙磺酸緩沖液，混勻孵育，加入氯化鈉溶液，再加入羅丹明B溶液，混勻后在570 nm波長處測定熒光信號強度來判斷待測溶液中17々-雌二醇的含量。進一步的，上述步驟(I)中，將功能核苷酸適配體配制成I ymol/L的母液，步驟(2)中氯化鈉配制成濃度為2 mol/L的母液、羅丹明B配制成500 ymol/L的母液。進一步的，所述的納米金通過以下方法制備:在100 mL煮沸的質量百分比濃度為0.01%的氯金酸溶液中，加入3.5 mL質量百分比濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，攪拌30分鐘，移除加熱裝置后繼續攪拌混合物10分鐘，最后，使溶液達到室溫并且使用0.2 μπι超濾膜過濾，然后儲存在恒溫為4°C的黑色玻璃瓶中備用。進一步的，上述步驟(I)中，檢測體系中功能核苷酸的終濃度為40 nmol/L，使用量為I μπιοΙ/L的母液取20 μ L，納米金的使用量為100 μ L，步驟(2)中，檢測體系中氯化鈉的濃度為140 mmol/L，使用量為2 mol/L母液取35 μ L，羅丹明B的濃度為10 ymol/L，使用量為200 μ mol/L母液取25 μ L0具體的，所述的檢測170-雌二醇的方法，還包括以下步驟: (1)一個建立已知170-雌二醇濃度的檢測體系的步驟，取11支分別加入20 μ L,1μ mol/L 17 β-雌二醇功能核酸適配體的離心管，加入100 μ L納米金溶液，充分混勻后將離心管置于25°C條件下孵育20 min，然后分別加入10 μ L不同濃度的17 β-雌二醇溶液和丙磺酸緩沖液，使得整個檢測體系中17 β -雌二醇溶液濃度維持在1000 nmol/L以下，充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育20 min，在上述混合液中加入35 yL、2 mol/L的氯化鈉溶液和25 μ L、200 μ mol/L的羅丹明B溶液，充分混勻，使得檢測體系溶液總體積達到500 μ L，留作以下測定用； (2)另取I支離心管將17β-雌二醇溶液用10 μ L超純水替代，按照上述步驟(I)的方法處理后作為空白對照體系溶液； (3)分別取500yL步驟(I)和步驟(2)制備的標準溶液和空白對照液，置于石英熒光比色皿中，所述的石英焚光比色皿的內徑為0.5 cm X 0.5 cm，外徑為1.0 cm X 1.0 cm，用熒光光度計進行掃描測定信號，掃描條件為:激發光狹縫為10 nm，發射光狹縫為2.5 nm,激發光波長為520 nm條件下掃描，獲得其熒光光譜信號，17 β-雌二醇和空白對照液的熒光強度信號分別為F和F。，計算增強的熒光強度值Λ F=F-F0; (4)以不同濃度170-雌二醇與對應增強熒光強度值AF作圖，繪制標準曲線； (5)制備樣品檢測體系:取10μ L待測樣品，加入到步驟(I)方法制備的檢測體系離心管中，充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育20 min后，在混合液中加入30 μ L、2mol/L的氯化鈉溶液和25 μ L、200 μ mol/L的羅丹明B溶液，混勻至檢測體系總體積達到500 μ L，按步驟(3)方法測定熒光信號并計算Λ F。(6)根據計算所得的AF值，查標準曲線，可以求得樣品中17 P-雌二醇含量。進一步，所述的緩沖液為丙磺酸緩沖液，濃度為lOmmol/L，PH值為7.0。本專利技術的原理是:通過將17 P-雌二醇適配體與納米金溶液混合，使得17 P-雌二醇適配體包裹在納米金的表面，當體系中存在Yl P-雌二醇時，包裹在納米金上的適配體會與17 P-雌二醇特異性結合，從而釋放出游離的納米金，加入氯化鈉鹽溶液之后，游離的納米金產生聚集，加入羅丹明B，聚集的納米金對羅丹明B熒光沒有淬滅作用；當體系中不存在17 P-雌二醇時，加入氯化鈉鹽溶液，納米金則處于分散狀態，加入羅丹明B，分散的納米金則對羅丹明B具有很強的淬滅作用。通過測定檢測體系在570 nm處的熒光信號的變化與17 β-雌二醇在不同濃度下的線性關系來實現對17 β-雌二醇的定量檢測。在各種信號表達的方法中，熒光法是一種簡單、快速、靈敏的檢測方法。本專利技術提供了一種操作簡單、靈敏度高、選擇性好、成本低且高效的17 0-雌二醇的檢測方法。本專利技術和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本專利技術提供的檢測方法不需要大型儀器設備，成本低，檢測靈敏度高，選擇性好，操作簡單且高效，可用于檢測水樣中17 P-雌二醇的含量，檢測的濃度范圍是0-1500 nmol/L,線性擬合直線方程為y=0.983x+2.69，最低檢測限為 0.51 nM。【附圖說明】圖1是本專利技術的原理示意圖。圖2是實施例中氯化鈉濃度優化示意圖。圖3是實施例中適配體濃度優化示意圖。圖4是實施例中羅丹明B濃度優化示意圖。圖5是實施例中不同濃度的17 β -雌二醇與增強的熒光強度關系示意圖。圖6是靶物質以及干擾物加入檢測體系后的增強熒光強度示意圖。【具體實施方式】實施例1 功能核酸適配體為一段功能核苷酸序列，根據文獻(Y.s.Kim, H.S.Jung, Τ.Matsuura, H.Y.Lee, T.Kawai and Μ.B.Gu, B1sensors & B1electronics, 2007,本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測17β?雌二醇的方法，其特征在于包括以下步驟：1）一個制備17β?雌二醇功能核酸適配體的步驟，所述的功能核酸適配體為一段功能核苷酸序列，所述的功能核苷酸的序列如SEQ?ID?NO:1所示；2）在適配體溶液中加入納米金溶液，混勻孵育，使得適配體包裹在納米金的表面，再加入待測17β?雌二醇的水溶液和丙磺酸緩沖液，混勻孵育，加入氯化鈉溶液，再加入羅丹明B溶液，混勻后在570?nm波長處測定熒光信號強度來判斷待測溶液中17β?雌二醇的含量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：夏兵，王魯梅，葉璟，張東偉，杜玉萍，邱志浩，
申請(專利權)人：上海應用技術學院，
類型：發明
國別省市：上海;31