本發明專利技術公開了塞來昔布在制備治療細粒棘球蚴病藥物中的應用，通過塞來昔布殺滅細粒棘球蚴病的病原-細粒棘球蚴絳蟲，具有顯著的抑制和殺滅細粒棘球蚴原頭節的效果，從而實現細粒棘球蚴病的治療。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及塞來昔布的藥學應用，屬于藥物化學領域。
技術介紹
細粒棘球蝴病(echinococcosis of the liver)亦稱囊性包蟲病(cysticechinococcosis，CE)，是由細粒棘球蝴絳蟲(echinococcosis granulosus,Eg)的中絳期幼蟲所致的一種人畜共患寄生蟲病，目前尚無特效治療藥物，手術仍為唯一有效的治療方法，但術中易造成包蟲囊腫囊液外溢，使原頭節殘留，這是導致該病復發的最主要原因，有時候也會導致腹膜內包蟲病的二次感染。如果能尋找一種能在短時間內殺死頭節又對周圍正常組織損傷小的藥物用于術后局部使用，對細粒棘球蝴病的治療和預防復發將會產生積極效果。
技術實現思路
申請人在長期研究中驚喜的發現將常見的非留體類抗炎藥塞來昔布用來抑制和殺滅原頭節的生長具有積極效果，可應用于細粒棘球蝴病及其衍生疾病的臨床治療。在本專利技術中，塞來昔布(celecoxib)是一種非留體類抗炎藥，傳統上用作骨關節炎，類風濕性關節炎，直腸息肉等的治療，也可通過抑制C0X-2而抑制多種腫瘤細胞的生長，促進其凋亡。首先，本專利技術公開了塞來昔布在制備治療細粒棘球蝴病藥物中的應用。細粒棘球蝴病，既可以是動物體上的，也可以是人體上的，根據該癥的臨床發病部位，通常指的是囊性肝包蟲病。因此，本專利技術還公開了塞來昔布在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應用。根據需要，可使用不同濃度的塞來昔布，一般來說，為了有效的殺滅病原，塞來昔布的用藥濃度不低于50 ymol/Lo針對常見的原頭節生長密度，申請人研究了不通濃度塞來昔布的殺滅效果，優選用藥濃度為100-200 ymol/Lo優選的，連續用藥時間不低于2天。在上述濃度下，對細粒棘球蝴原頭節具有比較理想的抑制和殺滅效果，從而可有效治療相關疾病。在此基礎上，本專利技術還公開了塞來昔布細粒棘球蝴原頭節抑制劑的應用。本領域技術人員可以理解，在多種實驗環境下，尤其是動物離體實驗情況下，為了防止由于動物體內的細粒棘球蝴原頭節在體外的生長和頭節外溢，需要加入必要的抑制劑，例如20%高滲鹽水等。與上述類似，作為抑制劑，塞來昔布的用藥濃度為不低于50 ymol/L，優選為100-200 μmol/Lo【附圖說明】圖1為塞來昔布對細粒棘球蝴原頭節形態的影響，其中，A:對照組原頭節；B =DMSO對照組原頭節；C:100 ymol/L的塞來昔布作用ID的原頭節；D:100ymol/L的塞來昔布作用3D的原頭節；E:150 ymol/L的塞來昔布作用ID的原頭節；F:150ymol/L的塞來昔布作用3D的原頭節；G:200 ymol/L的塞來昔布作用ID的原頭節；H:200 ymol/L的塞來昔布作用3D的原頭節。圖2為不同濃度的塞來昔布對細粒棘球蝴原頭節活力的影響。圖3為不同濃度塞來昔布作用細粒棘球蝴原頭節48h后磷酸化ERK2蛋白的表達效果。【具體實施方式】為了說明塞來昔布的應用效果，申請人進行了體外實驗說明塞來昔布對細粒棘球蝴原頭節的殺滅效果。實驗1:塞來昔布體外作用于細粒棘球蝴原頭節的效果取新鮮的自然感染細粒棘球蝴的綿羊肝臟，清潔羊肝表面，用75%酒精消毒表面，無菌條件下抽取含原頭節的囊液，移入無菌瓶中。用PBS (pH = 7.2)清洗原頭節3次至澄清，用0.1%伊紅染液做染色排斥實驗，98%以上拒染。肉眼觀察原頭節呈細白沙樣均勻顆粒，活性好的原頭節沉降速率快，活性不好的或者死亡的原頭節沉降速率相對比較慢。倒置顯微鏡下觀察未經處理的原頭節，蟲體呈內陷型，蟲體結構飽滿，呈橢圓形，結構清晰完整，鈣顆粒清亮而明顯。將原頭節分裝至含10%小牛血清的RPMI1640培養基中(青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL)，置37°C、5% 0)2培養箱內培養。實驗分組:塞來昔布對體外培養細粒棘球蝴原頭節的影響實驗分6組:RPMI1640空白對照組、DMSO組及藥物作用組(50 μ mo I/L組、100 μ mol/L組、150 μ mol/L組、200 ymol/I^)o取6孔板，每孔設5ml體系，按以上分組配制相應的培養液。將在體外培養5天后的細粒棘球蝴原頭節用PBS (pH = 7.2)清洗3遍，每組培養液中加入約2000個原頭節，置37°C，5% CO2孵育箱內培養，在倒置顯微鏡下觀察不同實驗分組對細粒棘球蝴原頭節形態和活力的影響。數據統計方法:加藥后24h開始，每組每天均勻抽取200 μ L培養液(平均含原頭節約90-120個)，用0.1 %伊紅染色15min，倒置顯微鏡下觀察原頭節的活力。活頭節拒染、不著色，且有活動性；死亡或活力減弱的原頭節紅染著色，伴有結構破壞。計算每組每天平均死亡率。每隔4d換液一次(每組體系和濃度同第一次加藥時)，連續觀察，直至最大作用濃度的原頭節全部死亡。實驗重復三次。實驗2:塞來昔布作用后P-ERK蛋白定量表達取出100，150，200 μ mol/L塞來昔布作用48h組，DMSO組及空白對照組的細粒棘球蝴原頭節，用PH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，棄上清液，在電子天平中各組稱取質量為1mg的細粒棘球蝴原頭節，加入150 μ LRIPA裂解液，用超聲粉碎儀迅速使原頭節粉碎。置于冰上裂解15min。然后移入高壓過且在冰上預冷的1.5mLEP管中，置4°C離心機中離心，12000g，25min，離心畢，小心抽取各管中的上清液置新的EP管中。提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量，每個泳道蛋白的溶液體積50 μ L，上樣于SDS-PAGE進行電泳分離后，轉移至PVDF膜，用5% BSA(內參用5%牛奶)均用TBST配制，在常溫下封閉2小時。一抗(β-actin，P-ERK2)效價均為1: 1000，4°C過夜，TBST洗膜6次，每次5min，隨后加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗小鼠效價為1: 25000)室溫下脫色搖床上搖動孵育2h.用TBST洗膜6次，每次5min。加入化學發光劑顯影.將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的相對分子質量和凈光密度值。每組實驗重復5次。實驗結果:參考圖1，倒置顯微鏡下觀察，剛從綿羊肝包蟲囊腫中抽取的原頭節的蟲體大多呈內陷型，形態呈橢圓形、近似圓形，體部飽滿，蟲體各部分清晰完整，蟲體內遍布著許多晶瑩光亮的鈣顆粒，伊紅拒染，且有活動性。原頭節活性不好或者死亡正常結構被破壞或顯示不清，并伊紅紅染，且無活動性。1640培養基正常體外培養5d后無明顯變化。倒置顯微鏡下觀察發現，不同濃度的塞來昔布作用細粒棘球蝴原頭節后，開始原頭節活動度較1640培養基對照組增強。藥物作用3d后，各濃度藥物作用組的原頭節均出現不同程度的形態變化，由內陷型變為外翻型，吸盤清晰可見，隨著藥物作用時間的延長，原頭節活動度逐漸減弱，并出現蟲體邊緣不規整，部分頭節由于應激會出現“吐泡”現象，頂突處可見大空泡產生，頭節體內鈣顆粒顯著減少。伊紅染色可觀察到原頭節紅染比例增加。參考圖2，顯示了不同濃度塞來昔布作用后的細粒棘球原頭節活力曲線。經X 2檢驗，各濃度塞來昔布組作用的原頭節死亡率與對照組比較差異有統計學意義(P < 0.05 =，DMSO組作用7d后活力(95.5% ±0.5% )和對照組(96.5% ±0.3% )比較差異無本文檔來自技高網...
【技術保護點】
塞來昔布在制備治療細粒棘球蚴病藥物中的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：呂海龍，姜玉峰，郭文平，
申請(專利權)人：呂海龍，
類型：發明
國別省市：新疆;65
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