類芽孢桿菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制備方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種類芽孢桿菌CGMCC?No.8333的凝乳酶粗提物及其制備方法。所述的方法包括以下的步驟：(1)將保藏編號為CGMCC?No.8333的類芽孢桿菌的種子液以0.4～3.2％的接種量接種于麩皮培養(yǎng)基震蕩發(fā)酵培養(yǎng)24～72小時得發(fā)酵液，所述震蕩發(fā)酵培養(yǎng)的轉速為160～180r/min，所述百分比為體積百分比；(2)將發(fā)酵液離心取上清液即可。所述的凝乳酶粗提物，總糖含量少，粘度較低，便于后續(xù)進一步的純化，較好地滿足了工業(yè)化生產凝乳酶的要求。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及一種類芽孢桿菌CGMCC No. 8333凝乳酶粗提 物及制備方法。
技術介紹
與植物來源和動物來源的凝乳酶相比較，微生物來源的凝乳酶具有生產成本低、 生化多樣性高、基因易改造的優(yōu)勢。目前，越來越多的報道說明微生物的胞外蛋白酶具有凝 乳功能，部分微生物的凝乳酶已實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產，并廣泛應用于干酪生產中。能夠產 生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要屬于放線菌、細菌和霉菌等的范疇，包括 放線菌中的鏈霉菌屬、小單孢菌屬、馬杜拉放線菌屬，霉菌中根霉、總狀毛霉、微小毛霉、米 黑毛霉、易脆毛霉，細菌中粟疫菌、寄生內座殼菌以及其他通過基因工程或輻照獲得的高產 凝乳酶的菌株。 將凝乳酶從發(fā)酵上清中分離出來并實現(xiàn)凝乳酶的高效回收是分離純化、酶學性質 研究以及工業(yè)化生產凝乳酶的前提和基礎。常用的分離方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法 (乙醇、丙酮）以及等電點法。然而這些方法適用于發(fā)酵上清黏度很低或不含有微生物胞外 多糖的情況。因此，探索開發(fā)一種能夠有效降低發(fā)酵液中糖類含量的發(fā)酵方式，對于分離純 化微生物源凝乳酶有著重要的意義。 中國專利申請（CN103740618A)公開了類芽孢桿菌屬的一個新菌種類芽孢桿菌 BD3526, Paenibacillusdamxungensissp. nov.,并且芽抱桿菌 BD3526 于 2013 年 10 月 14 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號為： CGMCC No. 8333。該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產胞外多糖的生理特性。但是 目前沒有從該菌株中獲得多糖含量較少的凝乳酶的記載。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題是，針對目前利用類芽孢桿菌麩皮發(fā)酵物制備凝乳酶 時，所得的發(fā)酵物粘稠難以將凝乳酶純化分離，所得的凝乳酶回收率低，難以滿足大規(guī)模工 業(yè)化生產的要求的不足，提供一種類芽孢桿菌CGMCC No. 8333的凝乳酶粗提物及其制備方 法。該方法在保證凝乳酶凝乳活力的前提下，有效降低了因多糖導致的發(fā)酵物黏度增加對 凝乳酶提取分離的影響。利用本專利技術所述的方法獲得的凝乳酶多糖等雜質含量較少，便于 大規(guī)模工業(yè)化生產。 本專利技術的專利技術人發(fā)現(xiàn)，由于類芽孢桿菌CGMCC No. 8333的發(fā)酵液中胞外多糖含量 較高造成所得類芽孢桿菌發(fā)酵液較為粘稠，采用乙醇沉淀類芽孢桿菌CGMCC No. 8333的發(fā) 酵液時，多糖類代謝產物易伴隨蛋白質沉淀析出。使離心后的上清液存在大量的糖類，粘度 過大，為后續(xù)凝乳酶的分離純化帶來一定的困難。然而通過適當延長類芽孢桿菌的發(fā)酵培 養(yǎng)時間、改變接種量以及降低搖床轉速等培養(yǎng)方式，能使發(fā)酵液中的胞外多糖物質被類芽 孢桿菌代謝，降低培養(yǎng)物中胞外多糖類物質含量，同時結合后續(xù)發(fā)酵液的提純工藝，能夠進 一步降低所得凝乳酶中的雜質，以提高類芽孢桿菌凝乳酶的回收率。 本專利技術提供一種制備類芽孢桿菌CGMCC No. 8333的凝乳酶粗提物的方法，其包括 以下的步驟： (1)將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌的種子液以0· 4~3. 2%的接種 量接種于麩皮培養(yǎng)基震蕩發(fā)酵培養(yǎng)24~72小時得發(fā)酵液，所述震蕩發(fā)酵培養(yǎng)的轉速為 160~180r/min，所述百分比為體積百分比； (2)將步驟（1)所得的發(fā)酵液離心取上清液即得凝乳酶粗提物。 步驟（1)為：將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌的種子液以0. 4~3. 2% 的接種量接種于麩皮培養(yǎng)基震蕩發(fā)酵培養(yǎng)24~72小時得發(fā)酵液，所述震蕩發(fā)酵培養(yǎng)的轉 速為160~180r/min，所述百分比為體積百分比。其中，所述種子液的獲得方式為本領域 常規(guī)的獲得方式。較佳地，將保藏編號為CGMCC No. 8333的類芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基上進 行種子培養(yǎng)獲得種子液。所述的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為本領域常規(guī)的培養(yǎng)基，較佳地為TYC 培養(yǎng)基，更佳地由以下組分組成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. Og/L， L-胱氨酸 0· 2g/L，乙酸鈉 20g/L，Na2SO4O. lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHC032g/ L，瓊脂15~20g/L，余量為水。所述種子培養(yǎng)的時間為本領域常規(guī)的時間，較佳地為20小 時。所述種子培養(yǎng)的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為30°C。所述的麩皮培養(yǎng)基為本領 域常規(guī)的麩皮培養(yǎng)基，其包括麩皮和水。所述的麩皮為本領域常規(guī)的麩皮，較佳地為小麥麩 皮。所述麩皮的含量為本領域常規(guī)的含量，較佳地為1 %~5%，更佳地為2%，所述百分比 為質量百分比。較佳地，所述發(fā)酵培養(yǎng)在錐形瓶中進行，更佳地在250mL錐形瓶中進行。所 述錐形瓶中所述的麩皮培養(yǎng)基的裝液量為本領域常規(guī)裝液量，較佳地為50mL。所述發(fā)酵培 養(yǎng)的時間為24~72h，較佳地為48~72h，更佳地為72h。所述種子液的接種量為0. 4~ 3. 2%，較佳地為0. 8~3. 2%，更佳地為0. 8%，所述百分比為體積百分比。所述震蕩發(fā)酵 培養(yǎng)的轉速為160~180r/min，較佳地為160~170r/min，更佳地為160r/min。所述發(fā)酵 培養(yǎng)的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為28~30°C，更佳地為30°C。 步驟⑵為：將步驟⑴所得的發(fā)酵液離心取上清液即得凝乳酶粗提物。其中，所 述離心完成后，初步獲得了凝乳酶含量較高的粗提物。所述離心的時間為本領域常規(guī)的時 間，較佳地為10~15分鐘。所述離心的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為4°C。所述離 心的速度為本領域常規(guī)的速度，較佳地為15000g。 本專利技術提供一種由所述方法制得的凝乳酶粗提物。 所述的凝乳酶粗提物為淺棕色粉末狀固體，且所述的凝乳酶粗提物中凝乳酶活 力達到2285. 71SU/mL，相對高轉速（300r/min)搖床培養(yǎng)，總糖含量由3. 71mg/mL降低至 I. 33mg/mL，總糖含量降低了 64. 2% ;相對于短時發(fā)酵（12h)，糖含量降低72. 68% ;相對于 高菌體接種濃度（4. 0% )，糖含量降低80. 41%。因此，利用本專利技術所述的方法制得的凝乳 酶粗提物，總糖含量少，粘度較低，便于后續(xù)進一步的純化，較好地滿足了工業(yè)化生產凝乳 酶的要求。 較佳地，所述的方法還包括以下的步驟： (3)將步驟（2)所得上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫酸銨的飽和 度為50~75 %，靜置混合液，離心收集沉淀物； (4)將步驟⑶所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。 步驟（3)為：將步驟（2)所得上清液與硫酸銨混合得混合液，所述混合液中硫酸銨 的飽和度為50~75%，靜置混合液，離心收集沉淀物。其中，較佳地，所述混合液中硫酸銨 的飽和度為60%。所述靜置的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為2~6°C。所述靜置的 時間為本領域常規(guī)的時間，較佳地為0~5小時，更佳地為2小時。所述離心的時間為本領 域常規(guī)的時間，較佳地為15分鐘。所述離心的溫度為本領域常規(guī)的溫度，較佳地為4°C。 步驟⑷為：將步驟⑶所得沉淀物溶解，離心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所 述溶解的溶劑為本領域常規(guī)的溶劑，較佳地為本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種制備類芽孢桿菌CGMCC?No.8333的凝乳酶粗提物的方法，其特征在于，其包括以下的步驟：(1)將保藏編號為CGMCC?No.8333的類芽孢桿菌的種子液以0.4～3.2％的接種量接種于麩皮培養(yǎng)基震蕩發(fā)酵培養(yǎng)24～72小時得發(fā)酵液，所述震蕩發(fā)酵培養(yǎng)的轉速為160～180r/min，所述百分比為體積百分比；(2)將步驟(1)所得的發(fā)酵液離心取上清液即得凝乳酶粗提物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：杭鋒，王欽博，劉振民，陳衛(wèi)，穆海波，王國驕，劉沛毅，洪青，雍靖怡，齊曉彥，
申請(專利權)人：光明乳業(yè)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31