VEGF與PDGFRβ雙特異性融合蛋白及其用途制造技術

提供的是VEGF與PDGFRβ雙特異性融合蛋白及其用途。更具體地，提供了包含VEGFR胞外配體結合結構域和PDGFRβ抗體片段的雙功能融合蛋白，可用于治療濕性老年性黃斑變性(AMD)以及其它任何能夠通過抑制VEGF和PDGF信號通路改善的疾病，比如腫瘤和糖尿病視網膜病變。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】VEGF與PDGFRβ雙特異性融合蛋白及其用途
本專利技術涉及一種VEGF與PDGFRβ雙特異性融合蛋白，包含其藥物組合物及其用途。
技術介紹
老年性黃斑變性(AMD)是一種致殘、致盲性疾病。其主要影響黃斑區或視網膜中負責高視敏度視力的中心區域，并且是導致老年人不可逆性視力喪失的原因。據統計，全世界超過3000萬人罹患此病。隨著中國人口老齡化逐漸加劇，目前該疾病已嚴重危害我國人民群眾的生命健康。AMD有兩種形式，干性AMD和濕性AMD。雖然干性AMD更常見，但一般導致較輕的、較緩慢的視力喪失。濕性AMD患者的視網膜之下生成新血管。當感光細胞和視網膜色素上皮細胞(RPE)細胞慢慢退化時，血管趨于從脈絡膜中的正常位置發展到視網膜之下的異常位置。這種異常的新血管生長被稱為脈絡膜新生血管(CNV)。這些異常血管滲漏流血，導致出血、腫脹、瘢痕組織和嚴重的視力喪失。只有10％左右的AMD患者是濕性類型，但是卻大約占AMD所導致的失明總數的90％。濕性老年視黃斑變性(AMD)已經成為65歲以上老年人失明的首要威脅。目前批準用于治療濕性AMD的治療方法包括激光凝固法、光動力療法和用于降低過剩VEGF的水平、或阻斷VEGF生成的抗血管藥物療法。根據部位，有時可以使用激光治療來破環濕性AMD中形成的異常血管。只有15％的濕性AMD適合采用激光治療，因為血管不能離黃斑部的中內區域太近。激光是光束，由血液色素、藥物和PRE細胞所吸收，并轉化為熱能而燒灼異常血管。由于刺激物依然沒有被去除，新生血管形成時常反復，導致視力喪失。光動力療法主要通過靜脈注入光敏藥物，繼而采用特定波長的非熱能激光照射脈絡膜新生血管病灶，將光敏藥物活化。用光動力療法治療濕性AMD，只能穩定或降低濕性AMD視力下降的風險。由于并非對因治療，光動力療法不能阻止復發的可能，一般需要多次治療。而且，治療后要避光48小時，以免發生光敏反應，造成皮膚灼傷。因此，給患者帶來很多痛苦。血小板衍生生長因子家族包括血小板生長因子(PDGF)和血管內皮細胞因子(VEGF)。每種生長因子均可由多種細胞產生，其受體均為酪氨酸激酶(RTK)型受體。血小板衍生生長因子家族成員包括：PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD、胎盤生長因子(Placentalgrowthfactor，PGF)以及血管內皮生長因子(VEGF、VEGF41、VEGFB、VEGFC、FIGF(也作VEGFD))等。VEGF是血管內皮細胞強有力和特有的促有絲分裂原，可促進血管生成過程的所有環節。在幾個研究血管生成的體內試驗中，VEGF均可誘導血管新生。在對體外培養的血管和淋巴管內皮細胞的試驗中，VEGF能促進內皮細胞增殖、遷移及管狀結構形成。VEGF可以增加毛細血管及后微靜脈的滲透性。皮膚或肌肉注射后，能迅速誘導連續性的內皮結構破壞(XieK，WeiD，HuagS.Transcriptionalanti-angiogenesistherapyofhumanpancreaticcancer[J].CytokineGrowthFactorRev2006，17：147-156)。各VEGF受體(VEGFR)的作用有所不同。VEGFR-2起著調節內皮生長、分化、滲透性的作用；而VEGFR-1則與調節內皮細胞移動、聚集有關，并且通過VEGFR-2抑制信號的傳導。VEGFR-3對于血管發育可能也有作用，但更獨特的是其在淋巴管組織中表達，可能對淋巴系統生成有重要作用(JoukovV，PajusolaK，KaipainenA，etal.AnovelvascularendothelialgrowthfactorVEGF-CisaligandfortheFlt4andKDRreceptortyrosinekinases[J].EMBOJ，2003，15(2)：290-298)。VEGF通過VEGFR發揮生物學效應。VEGF與VEGFR結合，使VEGFR二聚體化、自我磷酸化，通過多個細胞內途徑傳遞信號(包括MAPK、PI3激酶、Ras和磷脂酶C途徑等)，最終發揮作用。迄今，已發現VEGF有3個受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。前兩者主要在內皮細胞中表達，在腫瘤細胞中也有表達，而VEGFR-3主要在淋巴管組織中表達。其中前2個受體與VEGF-A親和力高，屬酪氨酸激酶家族。與VEGF-A結合導致其本身二聚化、胞內段酪氨酸自磷酸化、隨后激活下游信號蛋白而發揮其生理功能。前兩者主要在內皮細胞中表達，在腫瘤細胞中也有表達，而VEGFR-3主要在淋巴管組織中表達(OhH.Anovelmolecularmechanisminvolvingneuropilin-1forvascularendothelialgrowthfactor-inducedretinalangiogenesis.NipponGakkaiZasshi.2003-Nov：107(11)：651-656)。已知VEGF是與眼內病癥有關的新血管生成過程中關鍵的調節因子。眼液中VEGF水平與糖尿病患者和其它缺血性視網膜病患者的活性血管增生水平密切相關。其它研究證明了在AMD患者脈絡膜新生血管膜中存在VEGF。目前批準的用于治療濕性AMD的抗血管藥物，目的在于中和VEGF的作用，從面阻斷血管新生。例如：輝瑞的哌加他尼鈉(Pegaptanib，商品名Macugen)，其活性成分哌加他尼鈉是一種由28個核苷酸組成的“aptamer”，其三維結構使其能與細胞外的血管內皮生長因子受體(VEGF)結合，抑制VEGF與相應的受體結合。需要每六周經玻璃體內注射施用；諾華的蘭尼單抗(Ranibizumab，商品名Lucentis)，Lucentis中的活性成分蘭尼單抗是一種與VEGF結合的抗體片段，需要每個月進行玻璃體內注射；拜耳的艾力亞(VEGF-Trap-eye，商品名Eylea)，其活性成分阿普西柏是一種與VEGF結合的多肽片段，需要頭三個月每個月注射，之后每兩個月注射施用。但目前的標準藥物治療對相當一部分患者無效，比如目前標準的Ranibizumab治療只能提高1/3患者的視力，10％患者對該治療無反應；另外，大概70％患者經過抗VEGF治療后無明顯的視力增加。目前的藥物治療還存在適應性抗性，也就是患者在經過一段時間治療后對該治療藥物產生了抗性。同時由于目前的治療是通過眼內注射，每一次注射都不僅產生昂貴的治療費用，也會引起眼內感染，出血以及視網膜脫離，其中最值得重視的并發癥是眼內感染。一旦感染，后果不堪設想，有可能會失明。因此注射頻度的降低對于藥物的發展亦有重要意義。因此，這個領域需要更有效的治療，克服抗VEGF治療的抗性，以及延長抗VEGF藥物作用的時間(不需要一個月或者兩個月的眼底注射)，以期更有效，更安全。血小板衍生因子PDGF是創傷愈合過程中較早出現的生長因子之一。在創面愈合的全過程中起重要作用，主要表現在促進創面愈合方面。常見的PDGF是由兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同型或異型二聚體，這使PDGF具有多種形式的二聚體結構，即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC以及PDGF-DD。P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
PCT國內申請，權利要求書已公開。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.01.24 CN 20141003382151.一種雙特異性融合蛋白，包括VEGF結合肽、PDGFRβ結合肽和免疫球蛋白IgG的Fc段，還包括隔區，其中所述的雙特異性融合蛋白的氨基酸序列選自：SEQIDNO:19至SEQIDNO:24。2.一種如權利要求1所述的雙特異性融合蛋白的制備方法，包括：構建表達載體，將表達載體轉化至宿主細胞，在宿主細胞中表達，得到表達前體，將雙特異性融合蛋白分泌到細胞外，得到所述的雙特異性融合蛋白。3.一種用于制備如權利要求1所述的雙特異性融合蛋白的表達前體，其中所述表達前體由信號肽和如權利要求1所述的雙特異性融合蛋白組成；所述信號肽的氨基酸序列選自SEQIDNO:16或SEQIDNO:17；所述信號肽位于所述雙特異性融合蛋白的N端。4.一種編碼如權利要求3所述的表達前體的多核苷酸。5.一種含有如權利要求4所述的多核苷酸的表達載體。6.一種含有如權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：屈向東，曹國慶，葉鑫，陳侃，張蕾，許志賓，袁紀軍，張連山，潘琴，管雁賓，
申請(專利權)人：上海恒瑞醫藥有限公司，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31