一種克隆胚胎構建的改進方法技術

本發明專利技術涉及克隆技術領域，具體公開了一種克隆胚胎構建的改進方法。所述方法包含如下步驟：S1.將卵母細胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作；S2.將去除細胞核的胞質部分置于染色液滴中，直接在熒光鏡下觀察胞質的著色情況，然后將對應的去核干凈的卵母細胞備用；S3.將去核干凈的卵母細胞放入操作液滴B中靜置，然后移放到含有供體細胞的操作液滴C中，先將一枚卵母細胞與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚卵母細胞粘合在一起，其排列順序為體細胞一卵細胞一卵細胞；S4.將粘合好的體細胞一卵細胞一卵細胞先在融合激活液中靜置，再移到融合槽中進行電融合。該方法具有操作簡潔迅速、去核干凈且效率高、克隆效率高等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及克隆
，具體涉及一種克隆胚胎構建的改進方法。
技術介紹
動物克隆是指動物不經過有性生殖的方式而直接獲得與親本具有相同遺傳性狀后代的過程，包括孤雌生殖、卵裂球分離與培養、胚胎分割以及細胞核移植等。目前，廣為人知的動物克隆技術實際上就是指細胞核移植技術。傳統的細胞核移植技術通常是指通過顯微操作的方法，將供體細胞的細胞核注入預先去核的成熟卵母細胞或早期合子內，形成一個新的重構胚，重構胚經過融合激活后發生發育程序重編，經細胞分裂、分化并在代孕母體內發育成一個新的個體。包括卵母細胞去核、注供體細胞、融合供體細胞并激活、體外培養、胚胎移植等一系列操作的復雜過程，每一個操作步驟都會影響到核移植的最終效率。自1997年\Dolly\羊出生以來，研究者就不斷對核移植過程中的每個技術環節進行改進。手工克隆(handmadecloning，HMC)技術改進去核操作步驟，在體視顯微鏡下用特制的切割刀直接切割去核，然后將兩個不含有細胞核的半卵與一個供體細胞靠近并施以直流電脈沖使其融合，最后將重構胚單個培養。整個過程不需要顯微操作儀，Vajta等（Vajtaetal，2001）將其稱之為手工克隆。杜玉濤（2011）研究表明與傳統的體細胞核移植相比，手工克隆技術能大幅度提高體細胞核移植的囊胚率。將卵母細胞質中的核去除掉，這個過程稱之為去核。卵母細胞的去核是體細胞核移植技術的關鍵技術環節，在去除盡量少胞質的情況下同時保證去核干凈。若胞質去除過多，會使卵母細胞內累積的蛋白質，mRNA流失過多，影響供體細胞的重編程。若去核不完全會導致重構胚染色體非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發育受阻，胚胎早期死亡等。去核效率的高低直接關系到所構建克隆胚胎體外發育和受體移植妊娠率及產犢率的高低。傳統細胞核移植技術的去核方法有盲吸去核法，染色去核法和spindle-view法。但是每種方法都存在一定的缺點，人們一直在尋求更好的方法。比如（劉東，2004）的擠壓去核法，用玻璃針在極體附近透明帶刺穿一個切口，推擠卵母細胞,使第一極體連同其附近的1/4～1/3胞質溢出透明帶。（郭繼彤，2002）用蔗糖高滲溶液對牛卵母細胞進行短時培養,大部分卵母細胞的紡錘體部位突出于卵膜表面,指示去核操作。這些都是在嘗試對卵母細胞的去核操作方法進行改進。后來發展起來的手工克隆技術（Vajta2007）直接用刀切除一半卵，以達到去核干凈的目的。盲吸去核法（圖2）是根據成熟卵母細胞的特點，去除極體附近的約1/3胞質，達到去核目的，操作簡潔迅速，但是去核過程中會使卵母細胞第一極體的位置發生改變，影響去核效果，去核效率相對較低，一般在70%。染色法去核利用DNA特異性染料Hoechest33342將整個卵母細胞染色后，借助熒光顯微鏡顯示染色體去核的方法，可以去除少量胞質和保證100%去干凈，但是紫外線的照射會損傷胚胎活力（Tsunda，1988）。后來發展的spindle-view法，是利用偏振光折射直接獲取紡錘體鏡像，不需要染色就能觀察到卵母細胞內的紡錘體，去核率可以達到95%以上，但是價格昂貴，不利于推廣應用。手工去核直接用刀切，相對去除的胞質更多（圖1），然后再將2枚半卵融合彌補去除胞質過多的情況。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是，為了克服現有技術中的上述不足，提供一種克隆胚胎構建的改進方法。本專利技術所要解決的上述技術問題通過以下技術方案予以實現：一種克隆胚胎構建的改進方法，包含如下步驟：S1.將卵母細胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作；S2.將去除細胞核的胞質部分置于染色液滴中，直接在熒光鏡下觀察胞質的著色情況，然后將對應的去核干凈的卵母細胞備用；S3.將去核干凈的卵母細胞放入操作液滴B中靜置，然后移放到含有供體細胞的操作液滴C中，先將一枚卵母細胞與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚卵母細胞粘合在一起，其排列順序為體細胞一卵細胞一卵細胞；S4.將粘合好的體細胞一卵細胞一卵細胞先在融合激活液中靜置，再移到融合槽中進行電融合，即得克隆胚胎。本專利技術所述的克隆胚胎構建的改進方法，是專利技術經過大量的實驗摸索而得到的，該方法綜合了幾種現有技術的優點，摒棄了其缺點；如吸收了盲吸法（圖2）操作簡潔迅速的優點，克服了其去核效率相對較低的缺點；采用了改進的染色法，吸收了染色方法去核干凈（去核率100%）且效率高的優點，又避免了傳統方法中卵母細胞被紫外光照射，損傷胚胎活力的缺點；最后結合改進的手工克隆技術，融合更多的胞質，從而提高效率。優選地，所述的卵母細胞為豬卵母細胞；所述的供體細胞為豬供體細胞。優選地，S1.中所述的操作液滴A由無鈣的H-NCSU-23和7.5μg/ml細胞松弛素B（CB）組成；S2.中所述的染色液滴由無鈣的H-NCSU-23和10μg/ml的Hoechst33342組成；S3.中所述的操作液滴B由無鈣的H-NCSU-23和2mg/mL的植物凝集素(PHA)組成；S3.中所述的操作液滴C為無鈣的H-NCSU-23。優選地，S2.中所述的在熒光鏡下觀察胞質的著色情況的判斷方法為：若胞質只有1個點不發亮（圖4），則證明去核不干凈；若胞質有2點發亮（圖5），則證明對應的卵母細胞去核干凈。優選地，S3.中所述的靜置時間為1~10s。優選地，S4.中所述的靜置時間為1~5min。優選地，S4.中所述的融合激活液含有如下組分：0.25mol/LMannitol，0.1mmol/LCaCl2·2H2O，0.1mmol/LMg-Cl2·6H2O，0.5mmol/LHEPES，0.01%PVA(w/v)。優選地，S4.中所述的電融合使用直流電進行，參數為：80V/mm，100μs,脈沖次數為2~3次。優選地，在S4.中所述的融合槽中，卵母細胞胞質緊挨電極的一端，體細胞位于融合槽的中間。優選地，S1.中所述的去核操作和S2.中所述的染色操作在操作盤內完成操作；所述的操作盤（圖3）做成4排，每排含5個液滴，其中一排含操作液滴，緊鄰的一排含染色液滴。有益效果：本專利技術提供一種全新的克隆胚胎構建方法，其具有操作簡潔迅速、去核干凈且效率高、克隆效率高等優點；此外，經本專利技術方法得到的克隆胚胎可顯著提高胚胎體外發育的囊胚率。附圖說明圖1為手工去核技術示意圖。圖2為盲吸法去核技術示意圖。圖3為操作盤圖。圖4為熒光鏡下去核不干凈的胞質圖（A白光；B熒光）。圖5為熒光鏡下去核干凈的胞質圖（A白光；B熒光）。圖6為熒光顯微下鏡囊胚細胞計數圖。具體實施方式以下結合具體實施例來進一步解釋本專利技術，但實施例對本專利技術不做任何形式的限定。實驗研究所用試劑未經特殊說明均購自SIGMA公司。胎牛血清(GIBCO)，生理鹽水（紫光古漢集團衡陽制藥有限公司）；細胞培養相關耗材為Corning公司產品；卵母細胞成熟及細胞、胚胎培養耗材為NUNC公司產品。洗卵液為DPBS+P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種克隆胚胎構建的改進方法，其特征在于，包含如下步驟：S1.?將卵母細胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作；S2.將去除細胞核的胞質部分置于染色液滴中，直接在熒光鏡下觀察胞質的著色情況，然后將對應的去核干凈的卵母細胞備用；S3.?將去核干凈的卵母細胞放入操作液滴B中靜置，然后移放到含有供體細胞的操作液滴C中，先將一枚卵母細胞與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚卵母細胞粘合在一起，其排列順序為體細胞一卵細胞一卵細胞；S4.?將粘合好的體細胞一卵細胞一卵細胞先在融合激活液中靜置，再移到融合槽中進行電融合，即得克隆胚胎。

【技術特征摘要】
1.一種克隆胚胎構建的改進方法，其特征在于，包含如下步驟：
S1.將卵母細胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作；
S2.將去除細胞核的胞質部分置于染色液滴中，直接在熒光鏡下觀察胞質的著色情況，然后將對應的去核干凈的卵母細胞備用；
S3.將去核干凈的卵母細胞放入操作液滴B中靜置，然后移放到含有供體細胞的操作液滴C中，先將一枚卵母細胞與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚卵母細胞粘合在一起，其排列順序為體細胞一卵細胞一卵細胞；
S4.將粘合好的體細胞一卵細胞一卵細胞先在融合激活液中靜置，再移到融合槽中進行電融合，即得克隆胚胎。
2.根據權利要求1所述的改進方法，其特征在于，所述的卵母細胞為豬卵母細胞；所述的供體細胞為豬供體細胞。
3.根據權利要求1所述的改進方法，其特征在于，S1.中所述的操作液滴A由無鈣的H-NCSU-23和7.5μg/ml細胞松弛素B組成；
S2.中所述的染色液滴由無鈣的H-NCSU-23和10μg/ml的Hoechst33342組成；
S3.中所述的操作液滴B由無鈣的H-NCSU-23和2mg/mL的植物凝集素組成；
S3.中所述的操作液滴C為無鈣的H-NCSU-23。
4.根據權利要求1所述的改進方法，其特...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳珍芳，周榮，石俊松，麥然標，余婉嫻，
申請(專利權)人：廣東溫氏食品集團股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44