本發明專利技術提供了一種檢測鑒別N1、N2、N6和N8亞型流感病毒的方法，具體采用了一步熒光定量RT-PCR檢測方法，將Buffer、dNTP、Enhance?solution預混成2X?one-step?buffer，將多種酶配比進行混合，使實驗操作的反應液配制更為簡單方便，縮短操作時間，同時避免了操作污染，可定量幾十個拷貝數，甚至幾個拷貝，該方法操作簡便、敏感性好、方便快捷，適合開發檢測用的N1、N2、N6和N8鑒別檢測熒光定量RT-PCR試劑盒，用于N1、N2、N6和N8亞型的臨床鑒別診斷和流行病學調查，對我國流感的防控具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種鑒別流感病毒不同亞型的方法，具體涉及一種利用多重熒光定量 快速鑒別Nl、N2、N6、N8亞型流感病毒的方法。
技術介紹
流感病毒（Influenza Virus)屬正粘病毒科，為RNA病毒。根據病毒膜蛋白（M)和 核蛋白（NP)的差異，將流感病毒分為甲（A)、乙（B)、丙（C)三個大型。其中A型流感的流行 時間最長，危害最大，流行宿主范圍也最廣。根據病毒表面血凝素（HA)和神經氨酸酶（NA) 的結構及其基因特性的不同，又可分為不同亞型。目前A型流感病毒已發現的血凝素（HA) 有16個亞型，分別用H1、H2 -Hie來表示；神經氨酸酶有9個亞型，分別用NI、N2…N9 來表示。各亞型間的HA和NA交叉組成不同的亞型毒株，如H5N1、H5N2、H9N2、H5N6、H5N8、 H6N6、H10N8、H4N6、H1N1等。各亞型的基因序列有所不同，病毒特性和抗原性等亦有所不 同。其中就NA基因而言，NA1、NA2、NA6、NA8近年來在養禽業最常分離到，由這幾個亞型引 起的損失也最大。針對單一亞型的檢測不能快速及時的顯示結果，費用亦昂貴。因此建立 起針對Nl、N2、N6、N8四個亞型流感病毒的多重熒光定量RT-PCR方法，為臨床預防治療禽 病提供理論基礎。 流感病毒容易變異，變異形式有抗原性變異、溫度敏感性變異、宿主范圍等方面的 變異，但最主要的是抗原性變異。抗原性變異主要是表面抗原HA和NA易變異。流感病毒 表面抗原變異幅度的大小，直接影響到病毒傳播的能力。若變異幅度小，屬于量變，稱為抗 原漂移。如果抗原變異幅度大，屬于質變，稱為抗原性轉變，形成新的亞型，危害一般較大， 往往引起較大的流行，甚至世界性流行。如甲型流感病毒的HA、NA基因容易發生抗原轉變， 導致HA和NA的部分或大部分氨基酸發生改變，出現抗原性完全不同的新亞型。 流感病毒的檢測主要依靠實驗室進行確切診斷，常規的診斷方法主要包括血清學 檢測及病原的分離鑒定兩方面。病毒的分離是診斷該病最常用的方法之一，通常采用雞胚 接種分離流感病毒，經培養后的病毒經過血凝（HA)及血凝抑制（HI)實驗，可初步鑒定出流 感病毒。但是病毒分離無論是雞胚接種還是細胞分離都存在周期過長、不能準確區分病毒 亞型、準確性和敏感性差的問題。 隨著分子生物學的飛速發展，分子生物學技術已廣泛應用于流感病毒的測定。尤 其是近年來快速發展的熒光定量RT-PCR方法。熒光定量PCR通過對PCR擴增反應中每一 個循環產物熒光信號進行實時檢測，從而實現對起始模板定量及定性的分析。反轉錄和PCR 擴增又在同一管內完成，有助于減少操作污染，時間更短、靈敏度更高。在實時熒光定量 PCR反應中引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信 號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光 強度的變化來監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。最常用的探針是Taq Man 探針，該探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。其序列與目標序列上 游引物和下游引物之間的序列高度配對。其中，熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅基 團則在3'末端。常用的熒光基團有？41^￡1\￥1(：、冊父等。當完整的探針與目標序列配對 時，熒光基團發射的熒光基因與3'端的淬滅基團接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚 合酶的5'外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅基團分離。這樣隨著擴增循環 數的不斷增加，釋放出來的熒光基團也在不斷積累，因此熒光強度與擴增產物的數量呈正 比關系。 MGB探針的淬滅基團采用非焚光淬滅基團（Non-Fluorescent Quencher)，本身 不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高10° C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB 探針可以比普通Taq Man探針設計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大 為提尚。 目前，熒光定量PCR檢測被廣泛應用于病原微生物檢測、基因病診斷、傳染病檢測 和病變檢測等。 N1、N2、N6和N8亞型的AIVs是感染禽類并能致病的常見NA亞型，。目前檢測AIV 的方法多是針對其HA亞型的檢測，如Hl、H3、H4、H5、H7、H9等亞型，針對NA亞型的檢測技 術少有報道，尤其是針對多個NA亞型的鑒別診斷。因此，本研究建立了一種快速、敏感、特 異的多重熒光定量RT-PCR方法，可同時檢測Nl、N2、N6、N8亞型的流感病毒。
技術實現思路
為了解決以上技術問題，本專利技術提供了一種快速鑒別檢測N1、N2、N6、N8亞型流感 病毒的方法。 本專利技術的具體方案如下： 取以下濃度及體積的試劑置于反應管中混勻：N8RNA 模板 10ng-lyg; RNase-free ddH20 補至 25 y L ; 啟動熒光PCR儀器，將反應管放入PCR儀器中，RT-PCR反應條件：第一步20 min 42°C， 第二步94°C 1 min，第三步95°C 15s，60°C 30s，進行45個循環，4°C保存，注：60°C采集熒 光，記錄擴增曲線； N1 probe 5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記的淬滅基團為BQ1;N2 probe 5' 端標記的焚光報告基團是VIC，3'端標記的淬滅基團為BQ2 ;N6 probe 5'端標記的焚光報 告基團是FAM，3'端標記的淬滅基團為MGB ;N8 probe 5'端標記的熒光報告基團是VIC，3' 端標記的淬滅基團為MGB ; 所述附、吧、呢、呢1^4模板的制備方法如下： 分別取含取Nl、N2、N6、N8亞型的流感病毒，按照Trizol試劑說明提取病毒RNA :在 1. 5mL的無RNA酶的EP管中加入200 y L尿囊液和lmL的Trizol，充分混勻后在室溫放 置5分鐘，以徹底分離核蛋白復合體；加入0.2 mL的氯仿，加蓋好后劇烈震蕩15秒，在室 溫放置2-3min，然后離心12,000X g，15 min，4° C;離心后管內分成三層，下面的紅色 為酚-氯仿相，一個中間層，一面是無色的水相；RNA沉淀小心將上層水相轉移到另一 無RNA酶的EP管中，加入等量體積的預冷異丙醇，室溫靜置10 min，離心12, 000 Xg， 15min，4° C;離心后可以在管的側壁和底部看到絮狀膠樣沉淀；RNA洗滌去上清，向沉 淀中加入111^75%預冷的乙醇洗滌1^4沉淀，輕輕混勻，離心12,000 \8,5111111，4°(：;1^八 溶解去上清，超凈臺內風干RNA沉淀，加入20 y L DEPC水充分溶解RNA。 本專利技術可以的鑒別檢測Nl、N2、N6和N8亞型的流感病毒。【附圖說明】 圖1為N1基因的擴增曲線； 圖2為N2基因的擴增曲線； 圖3為N3基因的擴增曲線； 圖4為N4基因的擴增曲線； 圖5為四種基因共同的擴增曲線。【具體實施方式】 下面結合實施例對本專利技術作進一步的說明。 實施例1 材料與方法 一、材料 病毒模板： N1為兩株H5N1等量混合提取的RNA，N2為H5N2和H9N2樣品等量進行混本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種快速鑒別檢測N1、N2、N6、N8亞型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：取以下濃度及體積的試劑置于反應管中混勻：2X?one?step?RT?PCR?Buffer?????????????????????????????????????12.5μL；混合酶??????????????????????RNase?inhibitor?5U、M?MLV?40U?和Taq?HS?3U??；N1?fwd??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N1?rev??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N2?fwd??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N2?rev??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N6?fwd??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N6?rev??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N8?fwd??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N8?rev??20μM???????????????????????????????????????????0.25μL；N1probe????10μM?????????????????????????????????????????????0.25μL；N2?probe?????10μM????????????????????????????????????????????0.25μL；N6?probe?????10μM????????????????????????????????????????????0.25μL；N8probe??????10μM????????????????????????????????????????????0.25μL；N1RNA模板?????????????????????????????????????????????????10ng?1μg；N2RNA模板?????????????????????????????????????????????????10ng?1μg；N6RNA模板?????????????????????????????????????????????????10ng?1μg；N8RNA模板?????????????????????????????????????????????????10ng?1μg；RNase?free?ddH2O???????????????????????????????????????????補至25μL；啟動熒光PCR儀器，將反應管放入PCR儀器中，?RT?PCR反應條件：第一步20?min?42℃，第二步94℃?1?min，第三步95℃?15s，60℃?30s，進行45個循環，4℃?保存，注：60℃采集熒光，記錄擴增曲線；所述N1?fwd?的堿基序列如SEQ?IN?NO:1；N1?rev??的堿基序列如SEQ?IN?NO:2；N1probe?的堿基序列如SEQ?IN?NO:3；N2?fwd?的堿基序列如SEQ?IN?NO:4；N2?rev?的堿基序列如SEQ?IN?NO:5；N2?probe?的堿基序列如SEQ?IN?NO:6；N6?fwd?的堿基序列如SEQ?IN?NO:7；N6?rev??的堿基序列如SEQ?IN?NO:8；N6?probe?的堿基序列如SEQ?IN?NO:9；N8?fwd??的堿基序列如SEQ?IN?NO:10；N8?rev?的堿基序列如SEQ?IN?NO:11；N8probe??的堿基序列如SEQ?IN?NO:12；N1?probe?5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的淬滅基團為BQ1；N2?probe?5’端標記的熒光報告基團是VIC，3’端標記的淬滅基團為BQ2；N6?probe?5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的淬滅基團為MGB；N8?probe?5’端標記的熒光報告基團是VIC，3’端標記的淬滅基團為MGB；?所述N1、N2、N6、N8?RNA模板的制備方法如下：分別取含取N1、N2、N6、N8亞型的流感病毒，按照Trizol試劑說明提取病毒RNA：在1.5mL的無RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混勻后在室...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：董以雷，張玉霞，袁小遠，徐懷英，宋敏訓，艾武，亓麗紅，
申請(專利權)人：山東省農業科學院家禽研究所，
類型：發明
國別省市：山東;37
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