一種檢測雞固有免疫相關受體的試劑盒及應用制造技術

本發(fā)明專利技術提供一種檢測雞固有免疫相關受體的試劑盒及應用，用于TLR3，TLR7和MDA5基因轉錄水平的SYBR?Green?I熒光定量。本發(fā)明專利技術提供的試劑盒及檢測方法靈敏度高、特異性強、線性濃度范圍廣、重復性好、操作簡便及省時，可用于多種樣品類型雞免疫細胞受體的絕對或相對定量檢測。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及獸醫(yī)生物
的檢測方法，特別涉及檢測雞固有免疫細胞受體的 熒光定量PCR試劑盒及其應用。
技術介紹
固有免疫已逐漸成為獸醫(yī)免疫學研究中一個活躍的領域。Toll樣受體 3 (Toll-like receptor 3, TLR3)、Toll 樣受體 7 (Toll-like receptor 7, TLR7)和黑色素 瘤分化相關抗原5(Melanoma Differentiation-Associated protein 5，MDA5)是雞體識別 RNA病毒感染的主要模式識別受體，它通過激活相應配體，啟動固有免疫通路的信號傳導， 進而誘導產生干擾素和促炎性細胞因子，最終促進抗病毒物質的產生。 檢測病毒感染或疫苗免疫對雞固有免疫信號通路的影響，對于深入了解病毒的致 病機制，研究開發(fā)雞用新型疫苗、免疫增強劑以及抗病毒藥物，均具有非常重要的意義。熒 光定量PCR方法具有敏感、快速、實時和所需檢測樣品少等優(yōu)點。如果能夠開發(fā)出商品化的 熒光定量PCR系列試劑盒，用于雞固有免疫信號通路中相關受體、配體、細胞因子及效應分 子的標準化檢測，將為相關的科學研究和臨床應用帶來極大的便利。 目前尚無商品化的檢測雞固有免疫細胞受體TLR3, TLR7和MDA5水平的試劑盒。 熒光定量PCR檢測雞TLR3, TLR7和MDA5表達水平的技術，僅被部分研究型實驗室所掌握。 而且各實驗室所采用的引物、反應體系及循環(huán)參數(shù)各不相同，導致了實驗結果間的不可比 性。四川農業(yè)大學的汪銘書等公開了"檢測北京鴨免疫相關基因轉錄水平的試劑盒及其應 用"（申請?zhí)?01410664799. 4)的專利申請，其中包含了檢測北京鴨TLR3和TLR7基因轉錄 水平的檢測方法。但是，固有免疫系統(tǒng)具有嚴格的動物種屬的特異性，檢測鴨固有免疫基因 的方法無法用于雞固有免疫相關基因水平的檢測。而且，其技術僅能用于鴨相關基因的相 對定量檢測，不能用于絕對定量分析。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術旨在提供一種雞TLR3, TLR7和MDA5基因轉錄水平的SYBR Green I熒光定 量PCR試劑盒及其應用。本專利技術提供的檢測方法靈敏度高、特異性強、線性濃度范圍廣、重 復性好、操作簡便及省時，可用于多種樣品類型雞免疫細胞受體的絕對或相對定量檢測。 為了實現(xiàn)該目的，本專利技術設計和篩選了三對特異性引物，從新城疫病毒感染的雞 胚尿囊液中分別擴增出雞TLR3，TLR7和MDA5基因片段。然后，分別制備了這三個基因的質 粒標準品，用于熒光定量PCR反應條件的優(yōu)選和標準曲線的建立。通過實際樣品的檢測應 用評估，表明專利技術所提供的試劑盒可以用作雞正常生理狀態(tài)、疫苗免疫以及疾病狀態(tài)下，多 種樣品類型中雞TLR3, TLR7和MDA5基因的絕對或相對定量檢測。 本專利技術具體的技術方案如下： 1.提供了檢測雞TLR3，TLR7和MDA5基因的熒光定量PCR特異性引物。本專利技術使 用Primer Premier 5. 0設計特異性PCR引物，經過多對引物的篩選、得到擴增效率和特異 性好的三對特異性引物。其核苷酸序列分別為： 引物對一： TLR3 Chicken-U :5,-ACATTTGTAACACCCCGC-3，； TLR3 Chicken-L :5,-CATAGGCGTCATAATCAA-3' 預計擴增片段大小為255bp。 引物對二： TLR7 Chicken-U :5,-CTGGCCACAGATGTGACC-3，； TLR7 Chicken-L :5'-TTCAACTTGGCAGTGCAG-3' 預計擴增片段大小為215bp。 引物對三： MDA5 Chicken-U :5'-AGAAGTGTCTGGAGCTGG-3' ； MDA5 Chicken-L :5'-CGACTCTCAATAACAGTCT-3' 預計擴增片段大小為70bp。 2.提供了雞TLR3, TLR7和MDA5質粒標準品。將新城疫病毒感染11日齡的SPF雞 胚。在病毒感染24小時后收取雞胚尿囊液，應用Trizo 1法提取其總RNA，然后使用隨機引物 將RNA反轉錄為cDNA。分別使用上述三對引物進行PCR，擴增雞TLR3, TLR7和MDA5的基因片 段。目的長度的擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳回收后，與PUC57載體連接，轉化大腸桿菌。選 擇疑似陽性克隆進行測序。測序結果分別與雞TLR3的基因序列（GenBank Accession No.: KM486593)，雞 TLR7 的基因序列（GenBank Accession No. :KM486601)和雞MDA5 的基因序列 (GenBank Accession No. :AB371640)進行比對。測序正確的質粒分別命名為pUC57-TLR3 Ch，pUC57-TLR7 Ch 和 pUC57-MDA5 Ch。 3.本專利技術提供的檢測雞TLR3, TLR7和MDA5的試劑盒，包括質粒標準品（陽性模 板對照），濃度為10 y M的上游引物溶液，濃度為10 y M的下游引物溶液，2 X熒光定量PCR 預混液（Master Mix)，和熒光定量PCR緩沖液（Buffer)。 4.本專利技術可以用于檢測多種類型的樣品中雞TLR3，TLR7和MDA5的基因轉錄水平。 樣品類型包括但不限于：雞抗凝全血、雞脾臟淋巴細胞、雞外周血淋巴細胞、雞血清以及雞 胚尿囊液等。5.本專利技術提供的檢測雞TLR3, TLR7和MDA5的熒光定量PCR方法，包括以下步驟， a.待檢樣品cDNA的制備： 首先提取待檢樣品（如：雞抗凝全血、雞脾臟淋巴細胞、雞外周血淋巴細胞、雞血 清以及雞胚尿囊液）的RNA。然后，使用隨機引物進行反轉錄反應，制備樣品的cDNA。 b?配制PCR反應體系： PCR擴增反應的體系均為20 y 1，包括：2X熒光定量PCR預混液10 y 1，10 yM上游 引物1 y 1，10 y M下游引物1 y 1，熒光定量PCR緩沖液2 y 1，DNA模板2 y 1和ddH20 4 y 1。 c?設定PCR擴增反應的程序為： 95°C預變性2. 5分鐘；95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒擴增45個循環(huán)，每個循環(huán) 結束時檢測熒光；熔解曲線分析為95°C 15秒，60°C 50秒，95°C continuous ;最后37°C 30 秒結束。 d?結果分析： 調整熒光定量PCR的擴增基線和閾值設定，以閾值線不低于正常陰性對照擴增 曲線的最高點為準。在陽性對照（質粒標準品）為有效擴增，無模板對照（Non-template control, NTC)無擴增的前提下，讀取待測樣品的Ct值，進行結果判定：Ct值大于40的樣本 為陰性結果；Ct值小于或等于40的樣本為陽性結果。 根據(jù)單一樣本的Ct值，可以對其進行絕對定量。根據(jù)兩個或以上樣本的Ct值，可 以對這些樣品進行相對定量分析。 本專利技術的有益效果為： 1、用途多：本專利技術所建立的檢測方法可用于多種樣品類型（雞抗凝全血、雞脾臟 淋巴細胞、雞外周血淋巴細胞、雞血清和雞胚尿囊液等）中雞TLR3, TLR7和MDA5水平的絕 對定量或相對定量檢測。該方法可應用于病毒的致病機制的研究，雞用新型疫苗、免疫增強 劑以及抗病毒藥物的研究與開本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測雞固有免疫相關受體的試劑盒，其特征在于，包括三對特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列分別為：TLR3Chicken?U：5'?ACATTTGTAACACCCCGC?3'TLR3Chicken?L：5'?CATAGGCGTCATAATCAA?3'；TLR7Chicken?U：5'?CTGGCCACAGATGTGACC?3'TLR7Chicken?L：5'?TTCAACTTGGCAGTGCAG?3'；MDA5Chicken?U：5'?AGAAGTGTCTGGAGCTGG?3'MDA5Chicken?L：5'?CGACTCTCAATAACAGTCT?3'。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：黃艷艷，許傳田，吳家強，楊少華，黃慶華，張琳，朱曼玲，高丹丹，
申請(專利權)人：山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37