穿心蓮甲羥戊酸 5-焦磷酸脫羧酶基因制造技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，涉及穿心蓮甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶基因，具有SEQ?ID?NO:1序列。本發明專利技術所提供的MVD基因可以用于制備相應的DNA探針；可以用于穿心蓮內酯合成途徑的改造，提高活性成分合成量；可以轉入生物反應器，生產相應的代謝成分。以上發明專利技術，對于穿心蓮內酯相關產品的開發和利用，促進相關醫藥產業的可持續發展，具有重要的應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，涉及植物基因。 技術背景 穿心蓮內酯是從爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees) 中提取的次生代謝產物，被譽為天然、安全的中藥抗生素。臨床上已經開發出多種針劑， 被衛生部及國家中醫藥管理局列為急診科必備藥品之一。穿心蓮的起源中心是印度和 斯里蘭卡，目前種源嚴禁出口。我國引種穿心蓮的歷史較短，遺傳基礎狹窄，具有較高的 遺傳脆弱性。在穿心蓮內酯的生物合成途徑中，甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶（mevalonate disphosphate decarboxylase，MVD)可以提供穿心蓮內酯合成的前體物質，對產量高低起 決定作用。本專利技術提供了穿心蓮MVD基因，本專利技術所提供的MVD基因可以用于制備相應的 DNA探針；可以用于穿心蓮內酯合成途徑的改造，提高活性成分合成量；可以轉入生物反應 器，生產相應的代謝成分。以上專利技術，對于穿心蓮內酯相關產品的開發和利用，促進相關醫 藥產業的可持續發展，具有重要的應用價值。 說明書內容 本專利技術目的在于提供穿心蓮甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶基因及其表達的蛋白。 本專利技術穿心蓮甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶基因，其具有如SEQ ID N0:1所述序列。 所述基因對應的蛋白質，其序列如SEQ ID N0:2。 本專利技術的有益效果是：提供了穿心蓮甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶基因，為后續設計 引物、構建載體和遺傳轉化研究提供了便利，為今后進一步通過途徑調控提高植物中穿心 蓮內酯合成量，或者利用合成生物學方法生產穿心蓮內酯，促進相關中醫藥產業的發展奠 定了堅實的基礎。【附圖說明】 圖1提取獲得的穿心蓮總RNA【具體實施方式】 實施例1 1材料與方法 所有引物均由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。總RNA提取所用化學試劑購自生 工生物工程（上海）股份有限公司，其他分子生物學試劑購自寶生物工程（大連）有限公 司。PCR產物和陽性單克隆測序由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行。穿心蓮種植 在江西中醫藥大學神農園。 1.1 提取總 RNA 取穿心蓮新鮮的莖和葉約0? 5g，加入3ml總RNA提取液，迅速用研缽研磨粉碎，在65°C水浴lOmin，再加入3ml氯仿： 異戊醇（24 : 1)。lOOOOrpm 離心 lOmin 后，取上清 600 yl，加入 150yl LiCl，4°C過夜。 lOOOOrpm離心20min后，棄上清，再離心lmin，吸干上清。在沉淀中加入超純水50 y 1，3M NaCl 5yl，96%乙醇125yl，顛倒混勻，在-70°C沉淀30min。在4°C溫度下lOOOOrpm離心 20min后，棄上清，用600 y 1 70%乙醇洗滌兩遍，將沉淀溶解在30 y 1超純水中。用1 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測產物。 米用 Roche 逆轉錄試劑盒（Transcriptor cDNASynth. Kit 2)獲得 cDNA，每個樣品 的總體積20 y 1。首先在12 y 1總RNA中加入1 y 1 Anchored-oligo (dT) 18Primer，輕輕混 勻后，在65°C反應 lOmin;然后再加入4yl Buffer，0.5yl RNase Inhibitor，2yl dNTP mix，0. 5 y 1反轉錄酶，輕輕混勻，在55°C放置30min后，轉為85°C反應5min，4°C終止反 應。 1.2克隆MVD基因 米用Invitrogen公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNASynthesis Kit合成 cDNA第一鏈。 根據銀杏（Ginkgo boliba L. )MVD 基因（ACCESSION AY757921)全長序列，搜索穿心蓮轉錄組拼接序列數據庫。設計一對引物，ApMVD-F : 5' -ATGGCGGCTGAGAAATGGGTG-3' 和 ApMVD-R :5' -TCACTTGGGAAACCCGGTTTC-3'，從穿心蓮的 cDNA中擴增全長。 以cDNA第一鏈為模板，采用TaKaRa公司高保真DNA聚合酶擴增目標序列，反應 總體積為 50. 0 y 1，包括 1 y 1 cDNA，0? 25 y 1 Takara Prime STARHS DNAPolymerase，5 y 1 10Xbuffer，4 y 1 dNTP MIX(各 2. 5mM)，ApMVD-F 和 ApMVD-R 引物（10 y M)各 1. 5 y 1， 36. 75 yl ddH20。反應程序為 95°C預變性 lmin ;95°C變性 3〇8,57°(：退火3〇8,72°(：延伸 lmin，35個循環；72°C延伸7min終止反應。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測割膠回收后，采用Axygen離心柱型PCR產物純 化及膠回收試劑盒回收擴增產物，取2 y 1，添加2. 5 y 1連接緩沖液（Solution〗）后，與 0? 5 y 1克隆載體pMD18-T進行連接，總體積5 y 1 〇 在4 °C冰箱連接過夜（8~12h)后，轉化大腸桿菌DH5 a，涂布在LB平板上（含有 50mg/L氨芐青霉素），37°C倒置培養6~9h。挑取單克隆到LB液體培養基（含有50mg/L 氨芐青霉素Amp)內，待到液體培養基變渾濁（大約2h)，以培養大腸桿菌的菌液為模板，用 目的片段的上、下游引物進行PCR擴增，挑選陽性克隆，用M13Prime rs進行DNA測序。由蘇 州泓迅生物科技有限公司進行測序。 1. 3甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶酵母表達質粒的構建 利用引物對 pYES2/25Q-MVD-F (5, -TAGGTACCATGGCGGCTGAGAAATG-3'）和 pYES2 /25Q-MVD-R (5' -AGTCTAGATGGCCCATAGGGITCACT-3'），從陽性單克隆中擴增 MVD 基因的開 放閱讀框。上游引物的5'端引入了 Kpnl(GGTACC)酶切位點，下游引物的5'端引入了 Xba I(TCTAGA)酶切位點。PCR 擴增條件為 94°C 3min ;94°C 30s，67°C 30min, 72°C 2min， 33cycles ;72°C 10min。反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，切膠回收略大于lkb 的條帶。 用限制性內切酶Kpnl和Xba I分別酶切回收的產物和pYES2/25Q酵母表達質粒。 用PCR產物清潔試劑盒純化回收的兩種產物，用T4DNA連接酶進行連接。電擊法將連接產 物轉化到釀酒酵母中。 用PCR法鑒定陽性單克隆菌落，獲得可表達甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶的酵母菌。 2結果與分析 2. 1 總RNA提取 利用無液氮法，提取獲得了質量較好的穿心蓮總RNA(圖1)。 2. 2全長0RF擴增 在1200bp附近有一條明顯的條帶。膠回收后，進行TA克隆，測序，獲得1條MVD 基因的全長開放閱讀框，長1260bp，編碼由419個殘基組成的氨基酸序列。 2. 3酵母表達重組菌的獲得 經過電擊轉化后，獲得了可表達MVD蛋白的基因重組酵母工程菌，保存于YH)培養 基中。本專利技術基因編碼表達的MVD蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:2。【主權項】1. 穿本文檔來自技高網...

【技術保護點】
穿心蓮甲羥戊酸5?焦磷酸脫羧酶基因，其具有如SEQ?ID?NO:1所述序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉云，鐘國躍，陳蓉，
申請(專利權)人：江西中醫藥大學，
類型：發明
國別省市：江西;36