保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法技術

提供了一種保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法。該方法包括：將淋巴細胞體外培養增效劑懸浮于保存液中，以便獲得淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液；將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液于預定溫度下進行冷凍保存，其中，所述預定溫度為零下20攝氏度至零上4攝氏度。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法
本專利技術涉及細胞生物學領域，具體地，涉及保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法。
技術介紹
淋巴細胞在體外的增殖和分化受多種因素的調節，最常見的調節劑主要是可溶性細胞因子、各種天然細胞和基因重組工程細胞。在細胞的體外培養中，由于飼養細胞(FeederCells)或抗原呈遞細胞(APC)等固相化細胞因子對淋巴細胞的調節功能比游離的細胞因子更強，所以，目前常用飼養細胞或APC來促進淋巴細胞的增殖及活化。在實際應用中，為了不影響淋巴細胞在體外的增殖和活化，需要對飼養細胞和APC進行失活處理。目前常規的方法有伽瑪射線照射、UV照射、電休克、絲裂霉素化學處理法。但以上方法依存在無法大量制備、設備昂貴、操作不安全、滅活程度不好掌握、有殘存活細胞或徹底損壞細胞等缺陷。而且，以上方法制備的飼養細胞或APC都是細胞，為保證其生物學活性，必需存放在含有二甲亞楓(DMSO)或甘油的保存液中，含飼養細胞或APC的保存液在-80℃冰箱只能短期保存，長期保存只能是液氮。這種劑型及保存條件，對于條件較好的實驗室來說不成問題，但普通臨床試驗室或細胞臨床治療，則不能夠滿足。這種保存方法存在運輸的困難，高成本的弊端，而且，從細胞活性來說，從保存時的超低溫到使用時的解凍都會造成蛋白質及細胞骨架的損傷，嚴重影響產品的活性。因此，既有效又安全地保藏淋巴細胞體外增效劑是當今生物學的難題。
技術實現思路
本專利技術旨在至少在一定程度上解決以上技術問題之一。為此，本專利技術的一個目的在于提出一種保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法與制備。本專利技術將飼養細胞或抗原呈遞細胞通過洗滌處理，制備成細胞空殼。發現以這種細胞空殼作為淋巴細胞體外培養增效劑，保持了原有飼養細胞或APC的活性。同時，發現這種細胞體外培養增效劑的成分為蛋白質，蛋白質存放在含有甘油的保存液中，在零下20攝氏度至零上4攝氏度條件下可以長期保持活性；或通過加入人血清白蛋白后利用冷凍干燥工藝制備成凍干粉，凍干粉放置4攝氏度即可長期保存。同時，本專利技術的凍干粉劑型和液體劑型淋巴細胞體外增效劑都可以4℃運輸，既方便又價廉，因此，為規模化應用提供了保障。在本專利技術的一個方面，本專利技術提供了一種保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法。根據本專利技術的實施例，該方法包括：將淋巴細胞體外培養增效劑懸浮于保存液中，以便獲得淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液；將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液于預定溫度下進行冷凍保存，其中，所述預定溫度為零下20攝氏度至零上4攝氏度。專利技術人驚奇地發現，利用本專利技術的該方法，能夠有效保藏淋巴細胞體外培養增效劑，且該方法保存條件要求低，淋巴細胞體外培養增效劑活性保持高、活性保持時間長，可以4℃運輸，既方便又價廉。根據本專利技術實施例的保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法，還可以具有以下附加技術特征：根據本專利技術的實施例，所述淋巴細胞體外培養增效劑為用飼養細胞或APC制備的細胞空殼。根據本專利技術的實施例，所述保存液為含5-15體積％甘油的RPMI1640培養液。根據本專利技術的實施例，進一步包括：在將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液于預定溫度下進行冷凍保存之前，預先將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液進行冷凍干燥處理，其中，所述保存液為含有1-10體積％的人血清白蛋白的RPMI1640培養液。根據本專利技術的實施例，所述細胞空殼是通過以下步驟制備的：將細胞進行洗滌處理，以便獲得經過洗滌的細胞；將所述經過洗滌的細胞進行裂解處理，以便獲得細胞空殼，其中，所述細胞的表面具有能夠促進淋巴細胞增殖分化的細胞因子。專利技術人發現，利用本專利技術的該方法能夠快速有效地制備獲得所述細胞空殼，且該方法操作簡單、容易控制，易于實現大規模生產。需要說明的是，所述細胞的表面具有能夠促進淋巴細胞增殖的細胞因子，可以是所述細胞本身能夠在其表面表達所述細胞因子，也可以是通過基因工程方法(例如瞬時轉染或穩定表達)將所述細胞因子表達在所述細胞表面，還可以是在細胞表面吸附或交聯所述細胞因子。另外，所述細胞可以為原代細胞(例如外周血單核細胞)，也可以為傳代細胞(例如K562細胞)。根據本專利技術的實施例，所述洗滌處理進一步包括：將所述細胞懸浮于等滲溶液中，以便獲得細胞懸液；將所述細胞懸液進行離心處理，以便獲得所述經過洗滌的細胞。根據本專利技術的實施例，在將所述細胞懸浮于等滲溶液中之前，將所述等滲溶液預冷至4攝氏度。根據本專利技術的實施例，所述等滲溶液為pH為7.4的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)。根據本專利技術的實施例，所述裂解處理進一步包括：按照預定體積比例將所述經過洗滌的細胞懸浮于低滲溶液中，將所得到的細胞懸液靜置2小時，以便獲得細胞裂解物；將所述細胞裂解物進行離心處理，以便獲得所述細胞空殼。根據本專利技術的實施例，所述預定體積比例為1：40。由此，有利于提高細胞裂解的效率。根據本專利技術的實施例，在將所述經過洗滌的細胞懸浮于低滲溶液中之前，預先將所述低滲溶液預冷至4攝氏度。根據本專利技術的實施例，所述低滲溶液為低滲Tris鹽酸緩沖液。由此，有利于提高細胞裂解的效率。根據本專利技術的實施例，能夠促進淋巴細胞增殖的細胞因子為選自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21、CD19、CD64、CD86和4-1BBL的至少一種。在本專利技術的另一方面，本專利技術提供了一種保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法。根據本專利技術的實施例，該方法包括：將淋巴細胞體外培養增效劑懸浮于保存液中，以便獲得淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液；將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液進行冷凍干燥，以便獲得凍干粉劑型的淋巴細胞體外培養增效劑；將所述凍干粉劑型淋巴細胞體外培養增效劑于零下20攝氏度至零上4攝氏度保存，其中，所述保存液為含有1體積％-10體積％人血清白蛋白的RPMI1640培養液。在本專利技術的一個實施例中，通過以下步驟制備細胞空殼：：一)細胞空殼制備試劑：1)等滲PBS：0.15mol/L氯化鈉，pH7.4；2)低滲Tris鹽酸緩沖液：10mmol/L，pH7.4。二)操作步驟：1)細胞的收集及洗滌：將細胞懸浮于約3倍量預泠的pH7.4等滲PBS，4攝氏度600g(1500轉)離心10分鐘，除去上清，重復洗滌1-3次。2)裂解和細胞膜的洗滌：向洗凈的細胞，約按體積比1：40的比例加入預冷的10mmol/L低滲Tris鹽酸緩沖液，邊加邊緩慢攪拌，置4攝氏度冰箱中約2小時，使之完全裂解；然后于4攝氏度12000g(9000轉)離心10分鐘，使細胞膜沉淀。重復洗滌、離心3-5次，最后獲得細胞空殼。3)用冷藏保存液約按2×107個/ml細胞空殼的濃度稀釋和分裝，-20攝氏度至4攝氏度冰箱冷藏；或用冷凍保護液約按2×107/ml細胞空殼的濃度稀釋和分裝，冰凍干燥后，4攝氏度冰箱冷藏保存備用。為了驗證本專利技術淋巴細胞體外培養增效劑的劑型及其保存方法的產品穩定性，本專利技術同時也以從外周單核細胞(PBMC)中擴增活化其中的NK細胞的方法作為實施例。本領域技術人員可以理解，使用相應細胞空殼(飼養細胞或APC)按類似的方法就可以擴增活化CTL及Treg。具體方法步驟：1)自體血漿制備：抽取抗凝外周血50ml，700G，20min室溫離心；吸取血漿，置于水浴鍋中56℃，30min；然后4℃靜置15min；最后4℃，900G，離心30min，取自體血本文檔來自技高網...

【技術保護點】
PCT國內申請，權利要求書已公開。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種保藏淋巴細胞體外培養增效劑的方法，其特征在于，包括：將淋巴細胞體外培養增效劑懸浮于保存液中，以便獲得淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液；將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液于預定溫度下進行冷凍保存，其中，所述預定溫度為零下20攝氏度至零上4攝氏度，所述淋巴細胞體外培養增效劑為細胞空殼，所述細胞空殼是通過以下步驟制備的：將細胞進行洗滌處理，以便獲得經過洗滌的細胞；將所述經過洗滌的細胞進行低滲裂解處理，以便獲得細胞空殼，其中，所述細胞的表面具有能夠促進淋巴細胞增殖分化的細胞因子，所述裂解處理進一步包括：按照預定體積比例將所述經過洗滌的細胞懸浮于低滲溶液中，所述低滲溶液為預冷至4攝氏度、濃度為10mmol/L的低滲Tris鹽酸緩沖液，將所得到的細胞懸液于4攝氏度下靜置2小時，以便獲得細胞裂解物；將所述細胞裂解物進行離心處理3-5次，所述離心處理是在溫度為4攝氏度、轉速為9000轉/分鐘的條件下進行10分鐘，以便獲得所述細胞空殼。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述保存液為含5-15體積％甘油的RPMI1640。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括：在將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液于預定溫度下進行冷凍保存之前，預先將所述淋巴細胞體外培養增效劑懸浮液進行冷凍干燥處理，其中，所述保存液為含1-10體積％人血清白蛋白的RPMI1640培養液。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滌處理進一步包括：將所述細胞懸浮于等滲溶液中，以便獲得細胞懸液；將所述細胞懸液進行離心處理，以便獲得所述經過洗滌的細胞。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在將所述細胞懸浮于等滲溶液中之前...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張明杰，伍震懿，
申請(專利權)人：深圳市漢科生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44