具有頭孢類藥物抗性的乳酸菌及其制劑的制備與應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開具有頭孢類藥物抗性的乳酸菌及其制劑的制備與應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)用人體糞便在抗生素壓力下分離得到2株具有耐藥性的乳酸菌，并進(jìn)行了抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，以及檢測(cè)是否存在質(zhì)粒DNA；采用PCR擴(kuò)增分析菌株的耐藥基因定位情況，探索了乳酸菌耐抗生素的分子機(jī)制，并對(duì)篩選具有抗性基因乳酸菌進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)；對(duì)篩選的抗性菌株進(jìn)行驗(yàn)證是否對(duì)腸道失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用，采用“抗生素型腸道菌群失衡模型”，旨在為臨床上使用抗生素引起的腹瀉、菌群失調(diào)等疾病提供潛在的治療方法。本發(fā)明專利技術(shù)獲得的菌株，當(dāng)臨床再次使用抗生素時(shí)，腸道益生菌能夠在抗生素壓力下存活，而普通的益生菌則不能存活，因此，可為臨床上抗生素引起的腹瀉提供治療方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及具有頭孢類藥物抗性的乳酸菌及其制劑的制備與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
在人體內(nèi)居住著大量的微生物，其中主要的就是細(xì)菌類，據(jù)統(tǒng)計(jì)健康成人的腸道棲息著1000萬億個(gè)細(xì)菌，是人體細(xì)胞總數(shù)的10～20倍，有多達(dá)近500余種細(xì)菌，腸道細(xì)菌是人體最龐大、最重要的組成部分，平均每1克大便的細(xì)菌數(shù)量便達(dá)到了1012個(gè)。機(jī)體的宿主細(xì)胞、腸道微生物和其他微生物構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，相互影響形成了多種生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外普遍公認(rèn)的安全性益生菌菌種主要為乳桿菌屬Lactobacillus和雙歧桿菌屬Bifidobacterium，這兩類菌可以在健康成年人的腸道菌群中出現(xiàn)。腸道益生菌成分組成了機(jī)體重要功能，負(fù)責(zé)3個(gè)主要功能：抵制病原微生物的定植；提供營(yíng)養(yǎng)；免疫調(diào)節(jié)。益生菌能夠結(jié)合腸道上的位點(diǎn)，抑制病原微生物的結(jié)合，這種潛在的機(jī)制可能是有益菌能夠產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)抵制病原菌，包括競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)或者附著位點(diǎn)，產(chǎn)生抑制新陳代謝和抗病原菌作用，調(diào)節(jié)毒素的產(chǎn)生和活性。有益微生物通過提高日常飲食多糖的分解效應(yīng)和提供維生素，從而有助于為宿主提供營(yíng)養(yǎng)。許多研究已經(jīng)證實(shí)益生菌能刺激與獲得性免疫相關(guān)的功能，激活淋巴細(xì)胞并刺激抗體生成，能提高機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能，對(duì)腹瀉、炎癥、心血管疾病、肥胖等都具有潛在應(yīng)用價(jià)值。由于抗生素能殺死細(xì)菌，在疾病的救治中也發(fā)揮了不可替代的作用，在醫(yī)療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是，長(zhǎng)期使用抗生素及抗生素的濫用，使許多人腸道致病細(xì)菌獲得耐藥性，同時(shí)也抑制體內(nèi)的有益菌，使腸道菌群失衡，從而引起疾病的發(fā)生。抗生素所致的腸道生態(tài)平衡的改變，可能會(huì)導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)抗移植性的丟失和腸病原菌的過度繁殖，耐藥性菌株和條件致病菌的過度生長(zhǎng)，有益微生物的抑制，改變腸道生物菌群的功能。近十年來，國(guó)外在益生菌的耐藥性方面做了大量研究工作。D′AIMMO等較系統(tǒng)地報(bào)道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對(duì)卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關(guān)的基因，如Bifidobacteriumlongum抗四環(huán)素的基因tetW等；TOOMEYN等則進(jìn)一步研究報(bào)道了戊糖乳桿菌的抗四環(huán)素基因tetM在菌株間的轉(zhuǎn)移。LiviaqF等通過對(duì)Bacteroidesfragilis的研究得到cfxA基因?qū)︻^孢菌素以及β-內(nèi)酰胺類的的抗生素抗性起作用。通過研究?jī)芍闟taphylococcusaureus，得到慶大霉素抗性基因mecA、femA。這種抗藥基因在菌種間的轉(zhuǎn)移對(duì)于人類將是很大的威脅。乳酸菌在自然界分布廣泛，且作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥衛(wèi)生等相關(guān)領(lǐng)域。近年來，越來越多的研究表明，抗生素的廣泛應(yīng)用在治療疾病的同時(shí)，也使得環(huán)境中耐藥菌株的種類及數(shù)目增加。目前，人類對(duì)抗生素抗性的研究大多集中在致病菌上，對(duì)乳酸菌的抗生素抗性及抗性基因是否能夠水平轉(zhuǎn)移缺少系統(tǒng)性的研究，隨著益生乳酸菌的普及和廣泛應(yīng)用，人們對(duì)益生菌的研究越來越深入對(duì)于乳酸菌的抗生素抗性越來越關(guān)注。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本專利技術(shù)的首要目的在于提供一株具有頭孢類藥物抗性的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)。本專利技術(shù)的另一目的在于提供一株具有頭孢類藥物抗性的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)。本專利技術(shù)的另一目的在于提供一種用于治療腸道疾病的制劑。本專利技術(shù)的再一目的在于提供上述菌株以及制劑的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一株具有頭孢類藥物抗性的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)，名稱為長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)AnB16，于2014年9月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCM2014442；一株具有頭孢類藥物抗性的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)，名稱為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)AnL15，于2014年9月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCM2014441；一種用于治療腸道疾病的制劑，包括上述具有頭孢類藥物抗性的長(zhǎng)雙歧桿菌AnB16和/或嗜酸乳桿菌AnL15；本專利技術(shù)的機(jī)理是：用人體糞便在抗生素壓力選擇下分離得到具有耐藥性的乳酸菌，并進(jìn)行了10種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，以篩選到的對(duì)抗生素具有較高耐藥性的菌株為材料，采用PCR擴(kuò)增分析菌株的耐藥基因定位情況，探索了乳酸菌耐抗生素的分子機(jī)制，并對(duì)篩選具有抗性基因乳酸菌進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，對(duì)篩選的抗性菌株進(jìn)行驗(yàn)證是否對(duì)腸道失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用，采用“抗生素型腸道菌群失衡模型”，旨在為臨床上使用抗生素引起的腹瀉、菌群失調(diào)等疾病提供潛在的治療方法。本專利技術(shù)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：現(xiàn)有的益生菌多是多抗生素比較敏感的，而我們所篩選的是具有抗性的腸道益生菌菌株，當(dāng)臨床再次使用抗生素時(shí)，腸道益生菌能夠在抗生素壓力下存活，而普通的益生菌則沒有這個(gè)能力，因此，可以為臨床上抗生素引起的腹瀉提供治療方法。附圖說明圖1是粘附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱形圖；其中，A為Caco-2細(xì)胞的結(jié)果圖；B為Hela229細(xì)胞的結(jié)果圖；AnB16為B.longumAnB16；AnL15為L(zhǎng).acidophilusAnL15。圖2是頭孢耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道M：DNALadder2000；泳道AnB16：B.longumAnB16；泳道AnL15：L.acidophilusAnL15。圖3為HindIII酶酶切基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖和Southem雜交結(jié)果圖；圖A為HindIII酶酶切基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖B為southem雜交結(jié)果圖；泳道1：λHindIIIDNAladder；泳道2：L.rhamnosusGGATCC53103；泳道3：B.longumAnB16；泳道4：L.acidophilusAnL15。圖4為腸道菌群在不同處理?xiàng)l件下的變化的柱形圖。圖5為小鼠腸道糞便DGGE分析結(jié)果圖。圖6為益生菌對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用的過程圖。具體實(shí)施方法下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本專利技術(shù)的實(shí)施方法不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施例1益生菌初篩菌株的初篩包括分離的具體操作步驟(包括培養(yǎng)溫度、時(shí)間等)及各培養(yǎng)基本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株具有頭孢類藥物抗性的長(zhǎng)雙歧桿菌，其特征在于：名稱為長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium?longum)AnB16，于2014年9月23日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?M2014442。

【技術(shù)特征摘要】
1.一株具有頭孢類藥物抗性的長(zhǎng)雙歧桿菌，其特征在于：名稱為長(zhǎng)雙歧桿
菌(Bifidobacteriumlongum)AnB16，于2014年9月23日保藏于中國(guó)武漢市武漢
大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM2014442。
2.一株具有頭孢類藥物抗性的嗜酸乳桿菌，其特征在于：名稱為嗜酸乳桿
菌(Lactobacillusacidophilus)AnL15，于2014年9月23日保藏于中國(guó)武漢市武
漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM2014441。
3.一...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張靜，趙峰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣州智晟投資管理有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44