木糖醇和乙醇同時高溫高產工程菌株的構建及應用制造技術

本發明專利技術涉及木糖醇和乙醇同時高溫高產工程菌株的構建及應用，具體通過基因工程改造的方法將釀酒酵母的半乳糖透過酶(轉運半乳糖和葡萄糖的己糖的己糖轉運蛋白)(Saccharomyces?cerevisiae?galactose?permease)(ScGAL2)的N376F突變體基因在耐熱酵母菌株YZJ015中高效表達，同時敲除甘油-3磷酸脫氫酶(K.marxianus?glycerol-3-phosphate?dehydrogenase)(KmGPD1)基因切斷甘油生產支路，使獲得的菌株YZJ119獲得了在較高溫度(>42℃)下，高效地共利用和發酵葡萄糖和木糖生產乙醇和木糖醇的能力。在42℃條件下，YZJ119能夠同時利用43.95g/l木糖和83.11g/l葡萄糖在28h內生產40.43g/l木糖醇和34.66g/l乙醇，其生產速率分別為1.44g/l/h(木糖醇)和1.24g/l/h(乙醇)，得率分別為0.92g/g(木糖醇)和0.42g/g(乙醇)。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體地說，構建了能夠在較高溫度下同時利用葡萄糖 和木糖共發酵生產乙醇和木糖醇，并且生產速率大幅度提高的耐熱工程酵母。涉及通過工 程菌改造提高高溫下利用葡萄糖和木糖共發酵生產乙醇和木糖醇的領域。
技術介紹
木糖醇是一種五碳多元醇，是木糖代謝的正常中間產物（Vandeska et al.，1996)，它的性質決定了它在食品、醫藥等方面具有重要的應用價值。首先，在食品行 業中，木糖醇的甜味堪比蔗糖，可以作為甜味劑，同時與其它甜味劑相比，木糖醇的口感清 涼，而且木糖醇不能被口腔內酵母菌和細菌利用，因此可以預防齲齒，可作為兒童防蛀食品 的添加劑（Dominguez et al.，1997)。另外，由于木糖醇是微生物的不良培養基，因此可以 作為食品添加劑，延長食品的保鮮期。其次，在醫藥方面，它被用于靜脈滴注時，不需要胰 島素的促進作用，就可以透過細胞膜，促進肝糖元的增加，為細胞提供所需的能量，同時血 液中的丙酮酸、乳酸以及葡萄糖的含量會有所下降，無細胞毒性，因此可以作為糖尿病患者 的輔助治療試劑（Ahmad et al·，2011 ;Ghindea et al·，2010 ;Jeon et al·，2011 ;Ko et al. , 2011 ；Kumar et al. , 2009 ；Sasaki et al. , 2010)〇 木糖醇是木糖代謝的正常中間產物（Vandeska et al.，1996)。目前木糖醇的生產 主要是通過工業生產的方式。工業生產主要是化學加氫法，加氫需要高溫高壓，增加了生產 成本，同時工藝復雜、收率低，限制了木糖醇的大規模生產，并且加氫需要鎳的催化作用，這 就帶來了低食品安全和環境污染的隱患（Cheng et al.，2010)。針對化學法生產木糖醇存 在的問題，國際上從20世紀70年代開始研究用微生物法來生產木糖醇。微生物法的原理 是利用細胞內的木糖還原酶（XR)，將木糖還原為木糖醇，而不需要鎳的催化作用，保證的食 品安全卻又不會帶來環境污染；氫來自細胞內的還原性輔酶和氫離子，不需另行制氫，反應 在常溫常壓下進行，降低了成本。又由于酶的底物專一性，使得原料不必高度精制。因此， 利用微生物來生產木糖醇將具有污染少、成本低、產品質量高并且無環境污染等優點，具有 非常大的發展前景。 乙醇是醇類的一種，俗稱酒精。乙醇的用途很廣，在生物能源方面，由于它存在作 為化石燃料的替代者的潛力，因此在近年受到了很大的關注（Chen，2011)。乙醇調入汽油可 以作為車用燃料，也被稱為E型汽油，這樣的調和可以優化油品的性能和質量，從而降低一 氧化碳、碳氫化合物等主要污染物排放。在醫藥方面，乙醇是一種鎮靜劑，也可以用于醫藥 消毒。在食品方面，食用酒精可以用來勾兌白酒。另外，乙醇在化工行業也有重要的用途，可 以用作溶劑，作為有機合成的原料，用于各種化合物的結晶，還可以作為洗滌劑和萃取劑。 目前乙醇的生產包括工業生產和微生物生產兩種方式。工業生產是將乙烯與水合 成乙醇，而乙烯大量取自石油裂解氣，所以這種方法會受到石油資源的限制。另外，還需要 高溫高壓的條件，使乙醇的工業生產面臨高成本與環境污染的壓力。而利用微生物發酵糖 類生產乙醇，是一種可利用再生資源的生產方法，不僅能夠滿足對燃料等方面的需求，還可 以避免環境污染（Su et al.，2014)。因此目前越來越多的采用的是利用微生物生產的方式 的生產乙醇 本專利中用來生產木糖醇的菌株為馬克斯克魯維耐熱酵母K. marxianus。 K.marxianus在高溫下發酵有以下幾個優點：1.高溫下發酵可以降低發酵中的冷卻費 用；2.纖維素酶等的最適催化溫度較高，高溫會提高以淀粉、纖維素等生物質為原料的同 步糖化發酵（SSF)效率，促進糖化，減少在酶上的費用（Fonseca et al.，2008) Zhang et al.，2013) ;3.能在耐熱范圍內生存的微生物較少，因此，高溫會降低污染的風險。（Kumar et al.，2009 ;Zhang et al.，2013)。除此之外，Κ· marxianus 是一種 GRAS (general regarding as safe)酵母，廣泛的在乳制品、葡萄酒發酵制造中存在，對環境、動物及人類 是安全的微生物。它能夠在較高的溫度下生長，最高的菌株可在高達52°C生長，具有很高 的生長速率（〇· 86 - 0· 99h \ 40°C ) (Banat and Marchant, 1995)。K. marxianus 有很高的 代謝多樣性，能利用多種工業上的底物糖類生長發酵。能利用多種廉價底物、耐熱、高生長 率等特點，使其被認為是替代釀酒酵母用來進行工業發酵和外源蛋白表達的候選者。由于 K. marxianus有很多比釀酒酵母優秀的品質，K. marxianus被越來越多的用于生物能源的 生產（Fonseca et al.，2008)。所以利用K. marxianus發展成木糖醇生產菌株有非常重要 的應用價值。 木質纖維素生物質（如農業廢物玉米秸桿等）是豐富的可再生材料，同時木質纖 維素可以從農業廢物如玉米秸桿等中獲得，不會與糧食造成競爭。因此，利用生物從可再生 資源中生產有價值的產物木糖醇具有極大的經濟和環境意義。葡萄糖和木糖是其水解液 的最主要兩個單糖成份，要建立經濟的工業利用過程，需要對兩種糖的高效利用和發酵（Ha et al.，2011)，但目前的方法都不夠高效，尤其是葡萄糖和木糖同時存在時，由于葡萄糖抑 制效應，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而導致效率低下。各種工程菌株的構建， 使利用木糖發酵生產木糖醇的能力不斷提高，但是葡萄糖的抑制效應常常難以解除。在構 建的馬克思克魯維酵母菌株葡萄糖的抑制效應非常明顯，因此利用葡萄糖和木糖共同發酵 一直是一個瓶頸。
技術實現思路
本專利通過基因工程改造，最終獲得菌株YZJl 19,可以同時利用葡萄糖和木糖共 發酵，在高溫下同時利用葡萄糖和木糖的混合糖溶液生產木糖醇和乙醇，并在不影響乙醇 產量的前提下大幅度提高木糖醇的得率及生產速率，在利用木質纖維素生物質水解產物高 效生物轉化生產木糖醇和乙醇工業上有很巨大的應用前景。 本專利技術通過基因工程的方法，首先在耐熱酵母YZJ015中高效表達釀酒酵母的半乳 糖透過酶的N376F突變體（從釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303_1A(ATCC208352) 基因組中利用帶有突變位點的引物擴增并融合得到）（具體構建過程為PZJ061和 PZJ063)，從而使菌株共利用和發酵葡萄糖和木糖的能力大幅度的提高。其次，敲除基因 KmGPDl (GenBank，K. marxianus 基因組序列 AP012213, REGION: 378475. · 379641)從而切斷 甘油生產支路，使甘油的積累幾乎消失。構建了在較高溫度（>42°C)下能夠同時共利用和 發酵葡萄糖和木糖的高效生產乙醇和木糖醇的耐熱酵母K. marxianus菌株YZJ119。 本專利中的最終構建的YZJ119菌株在42°C條件下，以83. llg/Ι葡萄糖和 43. 95g/l木本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種能同時利用葡萄糖和木糖共發酵生產木糖醇和乙醇的耐熱工程酵母菌株，所述酵母菌株以在K.marxianus基礎上轉入了一個以上拷貝的脈孢霉木糖還原酶基因NcXR(Neurospora?crassa?xylose?reductase)的耐熱酵母作為宿主，并將一個以上拷貝的釀酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突變體基因在所述宿主中重組表達，和任選地敲除基因KmGPD1而獲得。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：洪泂，張標，張佳，
申請(專利權)人：中國科學技術大學，
類型：發明
國別省市：安徽;34