一種抗人Oct4單克隆抗體及其制備與應用制造技術

本發明專利技術涉及醫學生物工程技術領域，本發明專利技術提供了抗人Oct4單克隆抗體、用于制備該單克隆抗體的重組蛋白、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及該單克隆抗體在用于western?blot和免疫組化檢測樣本中Oct4的表達和在用于制備肝癌的預后評估制劑中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及醫學生物工程
，具體涉及一種抗人〇Ct4單克隆抗體、用于制 備該單克隆抗體的重組蛋白、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及該單克隆抗體在用 于檢測樣本中0ct4的表達和在用于制備肝癌的預后評估制劑中的應用。
技術介紹
0ct4 (Octamer-Binding Protein 4,又稱P0U5F1)是維持干細胞多能性與自我更 新的重要的轉錄因子，主要表達于胚胎干細胞、生殖干細胞以及未分化胚胎源性腫瘤中， 通過與靶基因的調控區結合，選擇性抑制分化基因或促進多能性基因的表達。Oct-4由 Pou5Fl基因 （Gene ID :5460)編碼，由于差異剪切有多個不同的亞型，分別稱為0ct4A(360 個氨基酸殘基，分子量39kD)、0ct4B (190個氨基酸殘基，分子量19kD)和0ct4Bl (265個氨 基酸殘基，分子量30kD)。只有0ct4A可以入核與0ct4調控基因的啟動子結合，調控一系列 維持干細胞多能性與自我更新的基因的表達。 腫瘤起始細胞（腫瘤干細胞）具有自我更新的能力，對放療或化療有更強的耐 受能力，在腫瘤的發生發展過程中起重要作用。肝癌中也存在腫瘤起始細胞，并且腫瘤起 始細胞的數目與肝癌的化療抵抗相關（參見文獻：Yang W et al.0V6+tumor-initiating cells contribute to tumor progression and invasion in human hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2012(57) :613 - 620)。但調控肝癌起始細胞的信號通路還不明確。 0ct4表達于肝癌起始細胞內，對這些細胞的"干性"具有重要作用，并且癌基因 PSMD10可 通過 WWP2 抑制 0ct4 的降解（參見文獻 Qian Y，et al.p28GANKPrevents Degradation of 0ct4 and Promotes Expansion of Tumor-Initiating Cells in Hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 2012 ； 142:1547-1558) 曾有報道影響肝癌預后的因素主要是腫瘤大小和血管侵犯，并通常伴隨腫瘤多發 性。目前，越來越多的研究表明預判肝癌的復發尚需發掘其他更為有效的預后因素。以往 研究提示肝癌起始細胞在肝癌發生發展中可能發揮了重要作用，但是它如何調控肝癌進程 尚不明確，至今未見肝癌干細胞及0ct4的表達水平可直接作為肝癌復發轉移的預后判斷 因素，以及用于肝癌個性化治療的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種抗人0ct4單克隆抗體、用于制備該單克隆抗體的重 組蛋白、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及該單克隆抗體的應用。 本專利技術人根據肝癌起始細胞中0ct4高表達及肝癌中ρ28ωΝΚ高表達現象，研究了 肝癌起始細胞中ρ28 ωΝΚ對0ct4調控的機制，通過實驗發現，蛋白ρ28 ωΝΚ能夠通過調控0ct4 降解酶WWP2的降解促進0ct4在肝癌起始細胞中的積累，并且發現肝癌患者樣本中p28 GANK 與0ct4的表達與肝癌患者的預后呈明顯負相關（參見文獻Qian Y，et al.p28GANKPrevents Degradation of 0ct4 and Promotes Expansion of Tumor-Initiating Cells in Hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 2〇12 ; 142:1547_1558)。如果應用 0ct4 的單克 隆抗體檢測肝癌患者組織樣本中0ct4的表達水平，依據0ct4的表達水平就能對患者的預 后作出預判分析；本專利技術進一步設想，如果用相應單克隆抗體抑制0ct4功能，阻斷0ct4的 促癌作用，就有可能對那些自身肝臟中0ct4本底表達水平較高的患者起到個性化的治療 效果。進而0ct4的單克隆抗體可以用于肝癌的預后判別以及個性化治療。 本專利技術的第一方面，提供了一種用于制備抗人0ct4單克隆抗體的多肽（重組蛋 白），其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的。 本專利技術按照上述氨基酸序列構建了原核表達質粒，在BL21(DE3)中進行表達，純 化后得到了重組蛋白，用于制備0ct4的單克隆抗體。 本專利技術的第二方面，提供了一種抗人0ct4單克隆抗體，是由保藏編號為CCTCC No :C2014205的雜交瘤細胞株分泌產生。 本專利技術提供了一種雜交瘤細胞株，其保藏編號為CCTCC No :C2014205。 本專利技術的雜交瘤細胞株，命名為Hyb-h0ct4-138。 本專利技術的第三方面，提供了一種如上所述的抗人0ct4單克隆抗體（鼠抗人0ct4 單克隆抗體）的制備方法，該方法的步驟如下： a)重組表達如SEQ ID NO :1所示的蛋白； b)將上述蛋白作為免疫原免疫小鼠； c)取免疫鼠的脾細胞融合； d)經多輪篩選出合成多肽反應陽性的細胞克隆，作為抗人0ct4單克隆抗體的雜 交瘤細胞株； e)通過在小鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，將腹水進行純化，得到抗人 0ct4的單克隆抗體。 所述的步驟a)，針對0ct4A的編碼框氨基酸全序列設計并合成引物進行PCR克隆， 獲得0ct4A的全長序列，序列SEQ ID NO :2所示。 將上述PCR得到的cDNA片段導入pET21a⑴重組載體中，將該載體轉化 BL21 (DE3)經誘導、裂解、純化后得到重組0ct4蛋白。 所述的步驟b)，將上述重組蛋白與弗氏佐劑混合，作為免疫原免疫小鼠。 所述的步驟c)，取免疫鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合；與小鼠的骨髓瘤細 胞SP2/0細胞融合，經篩選后即可獲得雜交瘤細胞。 本專利技術的雜交瘤細胞株，也稱雜交瘤細胞系Hyb-h0ct4_138(即保藏于中國典型 培養物保藏中心，保藏日期2015年1月24日，保藏編號CCTCC No :C2014205)，所制備的單 克隆抗體是一種免疫球蛋白，可特異性結合人0ct4蛋白。 本專利技術的第四方面，提供了一種如上所述的用于制備抗人0ct4單克隆抗體的多 肽（重組蛋白）、抗人0ct4單克隆抗體、分泌抗人0ct4單克隆抗體的雜交瘤細胞株在制備 檢測肝癌預后判別的試劑或試劑盒中的應用。 所述的檢測肝癌預后判別的試劑或試劑盒，優選Western Blot或免疫組化試劑或 試劑盒。 所述的檢測肝癌預后判別的試劑或試劑盒，優選本專利技術抗人0ct4單克隆抗體和 抗人p28 SANK的單克隆抗體聯用。 所述的肝癌患者的預后判別，是應用免疫組化的方法應用人0ct4單克隆抗體檢 測肝癌患者樣本中0ct4的表達情況，通過計算得出每位患者癌及癌旁組織中相應分子的 平均表達強度。利用統計軟件分析0ct4的表達與肝癌患者各種臨床特征及預后參數（總 生存率、無瘤生存率、總生存時間、無瘤生存時間等）的關系，制成曲線圖。 本專利技術為肝癌患者的預后判別提供了新的檢測方法，也為0ct4的臨床個性化治 療應用提供了新的思路。【附圖說明】 圖1是單克隆抗體Western Blot檢測人0ct4蛋白的掃描圖；其中，泳道1為 蛋本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于制備抗人Oct4單克隆抗體的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王紅陽，于樂興，文文，談冶雄，凌妍，陳淑楨，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：上海;31