本發明專利技術提供一株產膠原蛋白酶的菌株，該菌株產生的發酵液可以在溫和的條件下將鉻革屑完全水解。本發明專利技術提供的產膠原蛋白酶的菌株具體為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC?No.11218。本發明專利技術菌株的發酵液中膠原蛋白酶活力達到518.01U/mL，在37℃條件下發酵液24h內能夠有效水解鉻革屑，處理后水解液中游離鉻含量為處理前鉻屑中鉻含量的30-40％，發酵液對鉻離子的耐受度為0.8mg/mL，可用于工業含鉻革屑廢棄物的處理。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于工業微生物應用領域，具體涉及一株產膠原蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌及其水解鉻革屑的應用。
技術介紹
制革工業每年要產生大量的固體廢棄物，這些固體廢棄物主要由生物質-皮膠原構成，是原皮修邊角料、灰皮片削皮屑等不含鉻膠原和藍皮削勻、修邊等產生的含鉻膠原廢棄物。不含鉻廢棄物中主要被用于生產動物蛋白纖維、畜禽蛋白質飼料、人造腸衣和多肽物質等。含鉻廢棄物是膠原蛋白和Cr3+的復合物，不易被降解，既浪費資源，又會污染環境。傳統的堿水解或酸水解工藝，由于鉻分離困難、操作成本高、二次污染、水解產物的質量和應用等方面的原因，難于被廣泛采用。以酶為基礎的制革生物技術在清潔性、環境友好性方面獨具特色，這些技術在制革工業的廣泛應用，是解決制革工業嚴重污染，促進制革工業持續發展的重要途徑；因此，鉻屑的酶解及水解物的綜合利用是有望解決鉻屑污染，實現再生資源化的有效途徑。本專利技術從天津富盛皮革制品有限公司長期堆積廢鉻屑的土壤中，篩選到一株可以水解含鉻廢棄物的菌株，為制革工業含鉻廢棄物的清潔、環保處理途徑的開發奠定基礎。
技術實現思路
本專利技術提供一株產膠原蛋白酶的菌株，該菌株產生的發酵液可以在溫和的條件下將鉻革屑完全水解。本專利技術提供的產膠原蛋白酶的菌株具體為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.11218，分類命名：解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。本專利技術所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株通過以下方法分離、篩選得到：(1)稱取土樣2g，用18mL生理鹽水浸泡搖勻后，取1mL加入到裝有50mL/250mL富集培養基的三角瓶中，120～180r/min，33～37℃搖瓶培養1～2d；其中所述富集培養基：明膠10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，pH7.2～7.5。；(2)初篩：將步驟(1)制備的富集培養液梯度稀釋后涂布于初篩平板上，37℃培養箱中培養大約24h。觀察菌落生長情況，選取具有透明圈的菌落，轉接到初篩平板，編號記錄。挑選明膠水解圈與菌落直徑較大的菌株進行復篩；其中所述初篩培養基：明膠50g/L，NaCl0.1g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，pH7.2～7.5；(3)復篩：挑取步驟(2)中透明圈直徑比菌落直徑較大的菌落，接到50mL/250mL種子培養基中，搖瓶培養8～12h，再按照2％～5％的接種量接種到50mL/250mL的復篩培養基中，150～200r/min，搖瓶培養24～48h。8000r/min，5min離心后取上清液，測定膠原蛋白酶活力；其中所述種子培養基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH自然；復篩培養基：葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，CaC120.05g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，pH為7.0～7.5；(4)8000r/min離心步驟(3)得到的發酵液5min，取上清進行膠原蛋白酶活力的測定，篩選出一株膠原蛋白酶活力較高的菌株；(5)16SrDNA基因序列測定和分析。測序得到16SrDNA序列長度為1415bp，將該基因序列登陸Genbank，通過BLAST程序與GenBank中核酸數據進行對比分析，BLAST結果表明其與芽孢桿菌屬的多個解淀粉芽孢桿菌達到99％以上的同源性。經BLAST同源序列比較后，隨機抽取其中的若干個序列構建系統進化樹，結果見圖4。(6)經Biolog微生物自動分析系統，并且結合16SrDNA基因序列分析，鑒定本專利技術的菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。本專利技術菌株的發酵液中膠原蛋白酶活力達到518.01U/mL，在37℃條件下發酵液24h內能夠有效水解鉻革屑，處理后水解液中游離鉻含量為處理前鉻屑中鉻含量的30-40％，發酵液對鉻離子的耐受度為0.8mg/mL，可用于工業含鉻革屑廢棄物的處理。本專利技術的解淀粉芽孢菌株具有營養要求簡單、生長迅速、安全無毒等優點。研究表明，利用解淀粉芽孢桿菌發酵產生的酶液可以將鉻革屑水解的特點，將其應用鉻革屑的水解處理，在環境保護和資源重復利用方面具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1：本專利技術菌株菌落形態圖；圖2：本專利技術菌株個體形態圖；圖3：本專利技術菌株發酵液水解鉻革屑前后效果對比圖，其中，3a為發酵水解前，3b為發酵水解24h后；圖4：本專利技術菌株系統進化樹；圖5：鉻離子含量標準曲線；圖6：膠原蛋白酶鉻離子耐受曲線。具體實施方式下面通過具體的實施方案敘述本專利技術。除非特別說明，本專利技術中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本專利技術的范圍，本專利技術的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本專利技術實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。本專利技術所用培養基如下：富集培養基：明膠10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，pH7.2～7.5；初篩培養基：明膠50g/L，NaCl0.1g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，pH7.2～7.5；種子培養基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH自然；復篩培養基：葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，CaC12。實施例1：菌株的篩選、分離、鑒定(1)菌株的篩選和分離：本專利技術篩選菌株所用土樣采集自天津富盛皮革制品有限公司長期堆積廢皮屑的土壤中。①富集培養：稱取土樣2g，用生理鹽水18mL浸泡搖勻后，取1mL加入到裝有50mL/250mL富集培養基的三角瓶中，150～200r/min，33～37℃搖瓶培養1～2d。②初篩：將步驟①制備的富集培養液梯度稀釋后涂布于初篩平板上，37℃培養箱中約24h。觀察菌落生長情況，選取具有透明圈的菌落，轉接到初篩平板，編號記錄，挑選明膠水解圈與菌落直徑較大的菌株進本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株產膠原蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)，保藏編號為：CGMCC?No.11218。
【技術特征摘要】
1.一株產膠原蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus
amyloliquefaciens)，保藏編號為：CGMCCNo.11218。
2.利用權利要求1所述菌株產膠原蛋白酶的方法，其特征在于，所述菌株的發酵培養基為：
葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，CaC120.05g/L，
K2HPO4·3H2O2.5g\...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李玉，薛斌，王洪彬，路福平，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：天津;12
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