火焰南天竹的轉基因方法技術

本發明專利技術公開一種火焰南天竹的轉基因方法，包括：將外源質粒載體轉入農桿菌LBA4404中，獲得重組農桿菌；活化培養所述的重組農桿菌至OD600為0.4～0.6，然后侵染火焰南天竹的葉片外植體50～70min；侵染后的葉片外植體依次經誘芽培養、生根培養獲得火焰南天竹植株，從火焰南天竹植株中篩選得到轉基因火焰南天竹。本發明專利技術建立了一個高效、快速、穩定的火焰南天竹遺傳轉化體系，轉化率可達到10％以上，為進一步應用遺傳轉化方法改良火焰南天竹品種提供實踐基礎，有利于今后火焰南天竹分子育種工作的發展。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因工程
，尤其涉及一種。
技術介紹
火焰南天竹（NandinadomesticaFirepower)是一種新興的園林綠化樹種，現在 大量用于園林景觀中。火焰南天竹耐寒常綠，葉片橢圓或卵圓形，與原種披針形葉有明顯區 另IJ，這是優于原種的重要性狀?；鹧婺咸熘竦矫磕昵锾煊龅嚼淇諝猓~色便由綠色轉為鮮紅 色，葉片顏色能夠持續到第二年初春，因此在南方地區具有極佳的觀賞效果。在園林綠化 中，火焰南天竹可與山茶同時培植于樹壇中，也適宜種植在植物群落下層，豐富景觀層次。 同時，它又是一種具有良好發展前途的盆栽植物，并有較高的藥用價值?；鹧婺咸熘耦伾S 溫度降低逐漸變紅，一年四季均呈紅色的品種還沒有發現，培養四季均呈紅色的品種具有 更好的市場前景。隨著近年來分子生物學和基因工程的飛速發展，通過轉基因技術來進行 分子改良育種是非常方便快捷的育種手段。目前還未有關于火焰南天竹的轉基因報道，在其他物種的轉基因方法主要有農桿 菌介導法、基因槍法和電擊法，其中農桿菌介導的葉盤法是迄今為止植物轉基因研究中研 究最為成熟最常用的一種轉基因方法。雖然在其它植物中的有比較成熟的轉基因體系，但 是傳統方法費事費力，耗時間長，操作繁瑣而且效率很低，獲得的轉基因植株太少，給轉基 因植株的后期鑒定工作帶來了障礙。而且由于物種不同轉基因的方法也不同，借鑒其它植 物的轉基因方法成功率很低，因此如何獲得一個高效快速的火焰南天竹穩定轉化體系，是 火焰南天竹轉基因中亟待解決的一個問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有技術的缺陷而提供一種高效快速穩定的火焰南天 竹的轉基因方法，轉化率可達10%以上。 為達到上述目的，本專利技術是通過以下的技術方案來實現的： 本專利技術所述的，包括： (1)將外源質粒載體轉入農桿菌LBA4404中，獲得重組農桿菌； (2)活化培養所述的重組農桿菌至0D600為0? 4~0? 6,然后侵染火焰南天竹的葉 片外植體50~70min; (3)侵染后的葉片外植體依次經誘芽培養、生根培養獲得火焰南天竹植株，從火焰 南天竹植株中篩選得到轉基因火焰南天竹。 本專利技術以火焰南天竹的葉片為外植體，選用農桿菌LBA4404做為侵染菌株，采用 合適的菌液濃度和侵染時間，能夠成功獲得轉基因火焰南天竹，且轉化率可達10%以上。進 一步優選的，步驟（2)中，活化培養所述的重組農桿菌至0D600為0. 4,然后侵染火焰南天竹 的葉片外植體60min; 優選的，所述的外源質粒載體為PCAMBIA2301或攜帶外源基因的pCAMBIA2301。 優選的，侵染前，對所述的葉片外植體進行預培養。所述預培養的溫度為22~ 26°C，時間為7~9小時，光照為2000~3000LX。進一步的，所述預培養的溫度為25°C，時 間為8小時。一般，預培養的培養基為MS。 優選的，所述的葉片外植體為0. 2~0. 6cm2的葉塊。 優選的，所述侵染的方法為：使所述的葉片外植體浸沒在重組農桿菌菌液中，每隔 3~7min搖動菌液。 優選的，侵染后，吸干所述的葉片外植體表面的菌液后進行誘芽培養。 優選的，所述誘芽培養的培養基為添加抗生素、蔗糖、瓊脂、TDZ2~3mg/L和 2, 4-D0. 1~0. 3mg/L的MS培養基。進一步優選的，誘芽培養的培養基中，蔗糖的濃度為 30g/L，瓊脂的濃度為5. 5g/L，TDZ的濃度為2. 5mg/L，2, 4-D的濃度為0? 2mg/L。 優選的，所述生根培養的培養基為添加抗生素、蔗糖、瓊脂和NAA0. 3~0.5mg/L的 1/2MS培養基。進一步優選的，生根培養的培養基中，蔗糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為 5. 5g/L，NAA的濃度為 0? 4mg/L。 本領域人員可以知曉，在誘芽培養和生根培養的培養基中，抗生素的種類和濃度 根據外源質粒載體所攜帶的抗性基因而確定。 優選的，步驟（3)中，葉片外植體經誘芽培養后獲得無根植株，對所述的無根植株 進行鑒定，篩選出的轉基因無根植株，再對轉基因無根植株進行生根培養。 與現有技術相比，本專利技術的有益效果為： 本專利技術采用較低的侵染農桿菌菌液濃度（0D600值為0. 4~0. 6)，較長的侵染時間 (50~70min)，能夠減少農桿菌和其他雜菌污染，同時又提高了侵染效率。 本專利技術侵染農桿菌菌液中不添加任何的輔助侵染的藥品藥劑，減小對火焰南天竹 葉片外植體的傷害，提高葉片外植體培養的成活率和再生率，而傳統方法中常添加乙酰丁 香酮等輔助侵染的藥劑，會對葉片外植體造成傷害，降低葉片外植體的再生能力。 本專利技術使用攜帶強表達報告基因的載體PCAMBIA2301，通過觀察可直接篩選得到 轉基因植株，避免傳統的檢測中繁瑣的工作，縮短了轉基因的周期。 本專利技術建立了一個高效、快速、穩定的火焰南天竹遺傳轉化體系，轉化率可達到 10 %以上，為進一步應用遺傳轉化方法改良火焰南天竹品種提供實踐基礎，有利于今后火 焰南天竹分子育種工作的發展?！揪唧w實施方式】 下面結合具體實施例，進一步闡明本專利技術，應理解這些實施例僅用于說明本專利技術 而不用于限制本專利技術的范圍，在閱讀了本專利技術之后，本領域技術人員對本專利技術的各種等價 形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。 本專利技術【具體實施方式】采用的材料如下： 1、植物材料 火焰南天竹組培苗。 2、培養基 培養基的配方如下： 火焰南天竹繼代培養基（代號SI) :MS+ZT0? 6mg/L+IBA0? 2mg/L+葡萄糖15g/L+ 瓊脂粉 6g/L，pH5. 7 ; 火焰南天竹轉基因苗培養基（代號S2) :MS+蔗糖30g/L+瓊脂5. 5g/L+TDZ2. 5mg/ L+2, 4-D0? 2mg/L+ 卡那霉素 20mg/L+ 羧芐青霉素 400mg/L，pH5. 7 ; 火焰南天竹轉基因苗生根培養基（代號S3) :1/2MS培養基+蔗糖30g/L+瓊脂 5. 5g/L+NAA0. 4mg/L+ 卡那霉素 20mg/L+ 羧節青霉素 400mg/L，pH5. 7 ; YEB固體培養基：牛肉浸膏5g/L、酵母膏lg/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、MgS04*7H20 0? 4g/100ml和瓊脂I. 5g/100ml，PH7. 4 ; YEB液體培養基：牛肉浸膏5g/L、酵母膏lg/L、蛋白胨5g/L、鹿糖5g/L和 MgS04 ? 7H20 0. 4g/100ml,PH7. 4 ； 所有的培養基均高壓滅菌，冷卻備用。 3、菌株和植物表達載體 本專利技術中使用的侵染菌株是農桿菌菌株LBA4404,該菌株當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種火焰南天竹的轉基因方法，其特征在于，包括：(1)將外源質粒載體轉入農桿菌LBA4404中，獲得重組農桿菌；(2)活化培養所述的重組農桿菌至OD600為0.4～0.6，然后侵染火焰南天竹的葉片外植體50～70min；(3)侵染后的葉片外植體依次經誘芽培養、生根培養獲得火焰南天竹植株，從火焰南天竹植株中篩選得到轉基因火焰南天竹。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：賈思振，張立偉，王媛花，顏志明，
申請(專利權)人：江蘇農林職業技術學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32