本發明專利技術公開了Necrostatin-1作為中性粒細胞凋亡促進劑的應用。發明專利技術人對化合物5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮進行研究，發現5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮除公知的抑制程序性壞死的作用外，還具有促進中性粒細胞凋亡的作用，并可通過促進中性粒細胞的凋亡來治療中性粒細胞凋亡異常疾病，特別是LPS引起的急性肺損傷。5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮的分子小，不僅易被機體吸收，而且可以特異性的作用于中性粒細胞，促進中性粒細胞的凋亡，而對其他細胞的凋亡無影響。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及化合物的新應用，特別涉及Necrostatin-I作為中性粒細胞凋亡促進 劑的應用。
技術介紹
中性粒細胞（polymorphonuclearneutrophil，PMN)是血細胞中壽命最短的一種 細胞，為終末分化細胞，其在紅骨髓內分化、成熟，隨后釋放入血液循環中，在外周血中平均 半衰期為4-10小時，雖然它的生存時間比較短暫，但是在炎癥反應中卻發揮著非常重要的 作用，一方面它是機體免疫防御系統的第一道防線，另一方面如果它在炎癥灶內被過度激 活、延遲清除或繼發壞死，可通過釋放氧自由基和蛋白水解酶及其它有害內容物加重炎癥 反應和周圍組織損傷，甚至使炎癥迀延和慢性化，從而導致多種疾病產生如類風濕關節炎、 膿毒血癥、全身炎癥反應綜合征、急性冠脈綜合征、急性肺損傷等疾病。 因而，適時適度清除PMN可控制炎癥的發生、發展和轉歸。PMN凋亡是安全、快速、 非炎性清除PMN的有效途徑。凋亡的PMN不僅脫顆粒、吞噬等功能減弱，而且更易被吞噬細 胞識別和清除，攝取了凋亡PMN的吞噬細胞還可分泌轉化生長因子(TGF-P)和前列環 素PGE-2等抑炎介質。目前研究用于促進中性粒凋亡的藥物較少，主要有以下幾種。 1、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK)抑制劑。研究表明人中性粒細胞表達細胞周期 蛋白激酶⑶K1XDK2和⑶K5,細胞周期蛋白酶抑制劑R_roscovitine、NG7、Hymenialdisine 可通過抑制CDK的活性，促進中性粒細胞凋亡，可用于治療中性粒細胞凋亡異常的疾病如 急性肺損傷，胸膜炎，關節炎等。 2、脂氧素（lipoxins，LXs)，消退素（resolvins，Rvs)。研究表明它們可以通過一 種非炎性的形式阻止和減少中性粒細胞在炎癥部位的浸潤，促進巨噬細胞對凋亡中心粒細 胞（PMNs)和微生物攝取及清除。 3、NF-KB的抑制劑：NF-KB是調控PMN凋亡的重要轉錄因子，炎癥介質致PMN凋 亡延遲與NF-KB的激活有關；研究表明多種NF-KB抑制劑（gliotoxin，SN-50,PDTC)能 夠促進中性粒細胞的凋亡。 4、死亡受體Fas激動劑：死亡受體Fas激動劑可以通過提高Fas的表達，以及抑制 抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-I蛋白的表達等作用促進中性粒細胞的凋亡。 5、IL-10 :研究表明IL-10可以加強小鼠急性肺損傷肺臟中性粒細胞的清除，并可 拮抗LPS對中性粒細胞的凋亡抑制作用。 但以上這些藥物在推廣和應用中有明顯的缺陷，細胞周期蛋白依賴性激酶（⑶K) 抑制劑、死亡受體Fas激動劑不僅僅可以誘導中性粒細胞的凋亡，也可以引起其他正常細 胞的凋亡，如何在促進中性粒細胞凋亡的同時而又不影響其他細胞的凋亡很難解決。同樣 脂氧素、消退素、NF-kB的抑制劑、IL-10的靶點也比較多參與炎癥的多個環節，很難保證 在促進中性粒細胞凋亡的同時而不引起其他副作用，并且合成的價格較高很難應用于臨 床。因此開發出一種可以特異性的誘導中性粒細胞凋亡的藥物意義重大。 5-(1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮（Necrostatin-I)是最 近發現的一種可以特異性的抑制程序性壞死的藥物，分子量為259. 3D，屬于生物堿類物質。 既往的研究發現它對于凋亡和自噬沒有任何抑制作用，不具有直接的抗氧化作用，對于正 常細胞的形態、增殖、黏附以及ATP、鈣和氧自由基水平等均無顯著影響。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供Necrostatin-I作為中性粒細胞凋亡促進劑的應用。 現代醫學研究表明，中性粒細胞在炎癥反應中卻發揮著非常重要的作用，一方面 它是機體免疫防御系統的第一道防線，另一方面如果它在炎癥灶內被過度激活、延遲清除 或繼發壞死，可加重炎癥反應和周圍組織損傷而引起多種疾病，適時適度清除中性粒細胞 可控制炎癥的發生、發展和轉歸。中性粒細胞凋亡是安全、快速、非炎性清除PMN的有效途 徑?；谏鲜鏊枷?，專利技術人對化合物5- (1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑 烷酮進行研究，發現5-(lH-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮除公知的抑 制程序性壞死的作用外，還具有促進中性粒細胞凋亡的作用，并可通過促進中性粒細胞的 凋亡來治療中性粒細胞凋亡異常疾病，特別是LPS引起的急性肺損傷。 5- (1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮的分子小，不僅易被機體 吸收，而且可以特異性的作用于中性粒細胞，促進中性粒細胞的凋亡，而對其他細胞的凋亡 無影響?！靖綀D說明】 圖1是各組中性粒細胞凋亡率，Annexin-V陽性為凋亡細胞； 圖2是各組中性粒細胞凋亡率比較，（n彡3X0. 05/X0. 01與空白組相比）； 圖3是與Nec-I共培養的中性粒細胞的凋亡特征性表現，結果顯示出現了明顯的中性 粒細胞凋亡特征性表現，即中性粒細胞由分葉核到出現和濃縮現象； 圖4是中性粒細胞100yMNec-I共培養3h、6h、12h、18h后的中性粒細胞凋亡率檢測 結果，##與空白組相比，P〈〇. 05 ; 圖5是PBMC與20yM、50yM、100yMNec-I共培養20h后的PBMC凋亡率，與空白組相 比，P> 0? 05 ; 圖6是分離后的人中性粒細胞（5X106/ml)分別與Nec-I(IOOyM)、LPS(100ng/ml)、GM-CSF(20ng/ml)、dbcAMP(0.ImM)共培養20h后檢測各組中性粒細胞的凋亡情況； 圖7是Nec-I對中性粒細胞Bax、Mcl-1、cleavedcaspas-3蛋白表達的影響； 圖8 :a:各組小鼠肺泡灌洗液中總細胞數；b:各組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞數；c:各組小鼠肺泡灌洗液中總蛋白量；d:各組小鼠肺組織中MPO的活力；e:各組小鼠肺組織 干濕重比；ffiP彡0. 01與空白組相比，P彡0. 01與LPS組相比； 圖9 :a-c為各組肺泡灌洗液中細胞因子變化情況，d-e為各組肺組織中細胞因子變化， ##P彡0. 01與空白組相比廣P彡0. 01與LPS組相比； 圖10 :各組肺臟病理改變情況； 圖11 :a-b各組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞的凋亡率；##P< 0. 01與空白組相比， 0.Ol與LPS組相比； 圖12 :免疫熒光發檢測各組小鼠肺組織中性粒細胞的凋亡情況，采用MPO抗體標記中 性粒細胞，Cleavedcaspase3抗體標記凋亡細胞，MPO與Cleavedcaspase3雙陽性為凋亡 中性粒細胞?！揪唧w實施方式】 為了便于描述，以下將化合物5-(1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪 P坐燒酮（Necrostatin-1)簡稱為Nec-I。 下面結合實驗，進一步說明本專利技術的技術方案。 實驗一、Nec-I促進人中性粒細胞凋亡 1.實驗材料 I. 1中性粒細胞 南方醫科大學第三附屬醫院招募健康志愿者30名，告知志愿者實驗內容，簽署知情同 意書，倫理方案由南方醫科大學倫理委員會審核并通過。抽取志愿者外周血l〇ml，分離中性 粒細胞。 受試藥物 Nec-I加入DMSO溶解，配制成濃度為lOmg/ml的溶液，經0. 22mm微孔濾膜過濾滅菌處 理后，-2本文檔來自技高網...
【技術保護點】
Necrostatin?1作為中性粒細胞凋亡促進劑的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫爾維，接紅宇，何懿，周慶游，黃學嬋，勞小斌，譚禮平，韓艷萍，李杏，
申請(專利權)人：南方醫科大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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