一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質的方法技術

本發明專利技術公開了一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質（或疑似基因毒性）的方法。選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，以有機相與緩沖液的混合溶劑梯度洗脫作為流動相直接進行檢測。該檢測方法檢測靈敏度高、專屬性強、精密度高、準確性強、操作方便，且該方法的適用性很廣，有效控制原料藥的質量。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于藥物分析領域，具體地，涉及一種利用HPLC (高效液相色譜）測定磺酸 酯類基因毒性雜質的方法。
技術介紹
藥物合成中，甲磺酸、苯甲磺酸等磺酸類物質與微量的低級醇在合成反應中生成 烷基磺酸酯如甲磺酸甲酯（麗S)、甲磺酸乙酯（EMS)，正丁基甲磺酸酯（NBMS)，以及芳基磺 酸酯如苯磺酸甲酯（MBS)，苯磺酸乙酯（EBS)、對甲苯磺酸酯（MP-TS)，這些物質可與DNA發 生烷基化反應，從而可能成為引發癌癥的誘因，這些潛在基因毒性雜質的存在引起了管理 機構的高度重視，規定在原料藥中進行有關物質的嚴格控制，歐盟規定基因毒性雜質的限 度為最大日服量為1.5 μ g。 現有技術中存在使用HPLC法測定磺酸酯類雜質，HPLC-UV法是比較常用的檢測 方法，如PR-HPLC法測定苯磺酸氨氯地平中MBS、EBS，該方法采用Inretsil ODS色譜柱 (150mmX 4. 6mm，5Mm)，流動相為1%三乙胺（Ph 3. 0)-乙腈，其分離度和峰形較好，但是檢測 限較低，而且當被測物濃度較低時，可能不能檢測到紫外吸收，從而影響測定。 目前，我國常規藥物檢測分析方法的靈敏度僅為10至60ppm，根本無法對基因毒 性雜質進行定性和定量的分析，只能通過合成路線的不斷調整，避開可能會產生基因毒性 雜質的中間體和起始物料。 本專利申請人發現，用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，有機相與醋 酸鹽緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度洗脫，可檢測出磺酸酯類雜質，且靈敏度高（靈敏 度可達0. 75ppm)，可以有效控制原料藥質量，解決了基因毒性無法定性定量分析檢測的難 題。
技術實現思路
本專利技術提供一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質的方法，從而實現對痕量 磺酸酯類基因毒性雜質在原料藥中的控制。 本專利技術的技術方案：提供一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質的方法， 選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機相與緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度 洗脫。 檢測步驟如下： (1) 設定色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機相與緩沖液的 混合溶劑作為流動相梯度洗脫，柱溫20°c~30°C，流速為0.8~1.2mL/min，檢測波長為 260nm± IOnm ; (2) 配制樣品洛液：米用有機洛劑或有機洛劑和水的混合液將待檢測樣品配制成樣品 溶液； (3) 分離分析：將樣品溶液10 μ L，注入高效液相色譜儀，完成磺酸酯類基因毒性雜質 的測定。 所述有機相為選自乙腈。 所述緩沖液為醋酸鹽沖液。緩沖液的濃度范圍為〇· 〇〇5mol/L~0· 05mol/L，優選 0.01mol/L〇 所述緩沖液的pH值為3. 0~5. 1。 所述流動相為有機相與緩沖液的混合溶劑梯度洗脫，梯度洗脫0~5min時，緩沖 液、有機相的比例為體積比90%: 10% ;5~Hmin時，緩沖液體積比減小為80%，有機相體積 比增加為20% ;14~15min,緩沖液比例為體積比減少為10%,有機相的比例為體積比增加 為90% : 15~25min時，緩沖液、有機相的比例為體積比10%: 90%不變；25~30min時，緩 沖液體積比增加為90%，有機相體積比減少為10% ;30~35min時，緩沖液、有機相的比例 為體積比90%: 10%不變。 所述的檢測條件：柱溫20°C~30°C，優選25°C ;流速為0· 8~L 2mL/min，優選 1.0 mL/min。檢測波長為 260nm± 10nm，優選 260nm。 本專利技術所述的檢測方法，可以依照以下方法實現： (1)取待檢測樣品適量，用乙腈或它與水的混合溶劑溶解，配制成合適濃度的樣品溶 液。 (2)取磺酸酯類雜質適量，用乙腈或它與水的混合溶劑溶解，配制成合適濃度的對 照品洛液。 (3)設置流動相流速為0. 8~I. 2mL/min，流動相的流速優選為1.0 mL/min ;檢測 波長260nm ;色譜柱溫度為20°C~30°C，優選為25°C。 (4)分別取（1)、2)的樣品溶液和對照品溶液10μ L，注入高效液相色譜儀，完成磺 酸酯類毒性雜質的含量測定。 本專利技術的技術效果：通過利用HPLC，對原料藥中基因毒性雜質(或疑似基因毒性） 磺酸酯類毒性雜質進行痕量檢測分析，靈敏度可達〇. 75ppm。【具體實施方式】 下面詳細描述本專利技術的實施例，需要說明的是下面描述的實施例是示例性的，僅 用于解釋本專利技術，而不能理解為對本專利技術的限制。另外，如果沒有明確說明，在下面的 實施例中所采用的所有試劑均為市場上可以購得的，或者可以按照文本或已知的方法合成 的，對于沒有列出的反應條件，也均為本領域技術人員容易獲得的。 實施例1 儀器：Agilentl260高效液相色譜儀，1260紫外檢測器 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流動相A :0· 01m〇l/L的醋酸銨緩沖液（ρΗ5· I) 流動相B :乙腈 梯度洗脫見下表；流速：1. OmL/min 檢測波長：260nm 柱溫：25°C 進樣體積：1〇 μ L 稀釋劑：乙腈 試驗步驟： 供試品溶液：稱取苯磺酸氨氯地平樣品I. 〇〇14g置IOmL量瓶，用稀釋劑溶解并稀釋 至刻度，搖勻。 對照品溶液：精密稱取對苯磺酸甲酯對照品7. 48mg置IOOmL量瓶中，用水溶解 并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液A。精密量取1.0 mL貯備液A置IOOmL量瓶中，用稀釋劑 稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液B，精密量取1.0 mL貯備液B置IOmL量瓶中，用稀釋劑稀釋 至刻度，搖勻，作為對照品溶液（0. 75ppm)。 分別取對照品、供試品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖，圖中保留時間為6. 282min色譜峰為的苯磺酸甲酯色譜峰，采用面積歸一化法計算雜質 含量。 結論：苯磺酸氨氯地平樣品中的苯磺酸甲酯小于0. 75ppm。 實施例2 儀器：Agilentl260高效液相色譜儀，1260紫外檢測器 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流動相A :0· Olmol/L的醋酸銨緩沖液（ρΗ3· 0) 流動相B :乙腈 梯度洗脫見下表； 流速：1. OmL/min檢測波長：250nm 柱溫：20°C 進樣體積：1〇 μ L 稀釋劑：乙腈 試驗步驟： 供試品洛液：稱取甲橫Ife加雷沙星粗品l.〇〇14g直IOmL量瓶，用f布釋劑洛解并f布釋 至刻度，搖勻。 對照品溶液：精密稱取甲磺酸甲酯對照品37. 42mg置IOOmL量瓶中，用稀釋劑溶 解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液A。精密量取1.0 mL貯備液A置IOOmL量瓶中，用 稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液B，精密量取1.0 mL貯備液B置IOOmL量瓶中，用稀 釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（3. 75ppm)。 分別取對照品、供試品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖，圖中保留時間為4. 545min色譜峰為甲磺酸甲酯色譜峰，采用面積歸一化法計算雜質含 量。 結論：本方法適用于檢測甲磺酸加雷沙星樣品中不同濃度范圍的甲磺酸甲酯的含 量。 對照例1 采用現有本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用?HPLC?測定磺酸酯類基因毒性雜質的方法，其特征在于?：（1）色譜條件?：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機相與緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度洗脫，柱溫?20℃～?30℃，流速為?0.8?～1.2mL/min，檢測波長為?260nm±10nm?；（2）樣品溶液的配制?：采用有機溶劑或有機溶劑和水的混合液將待檢測樣品配制成樣品溶液?；（3）分離分析?：將樣品溶液?10μL，注入高效液相色譜儀，完成磺酸酯類毒性雜質的測定。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴潔，李軒，
申請(專利權)人：天津市漢康醫藥生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12