本發明專利技術涉及一種快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作用的方法，包括如下步驟：(1)將受精后正常斑馬魚胚胎移入培養孔中；(2)對培養孔中的斑馬魚胚胎連續給藥孵育，記為待測化合物組；(3)觀察斑馬魚胚胎肝臟，記錄并計算斑馬魚胚胎肝臟面積和斑馬魚胚胎體面積；(4)根據待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數與正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數的范圍的關系，判斷待測化合物是否具有肝臟毒性；本發明專利技術首次將肝臟面積指數作為斑馬魚肝功能評價的檢測指標，更加科學、客觀，提高了結果的準確性。建立的化合物對斑馬魚肝功能損傷作用的評價模型具有制作簡單、快速、穩定可靠和重復性好的優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術設及，屬于毒理學 檢測
技術介紹
藥物毒性問題是醫藥行業發展的關鍵問題，藥物性肝損傷是最常見的藥物不良反 應。隨著新藥的不斷問世，藥物性肝損傷的發病率也相應增加。很多藥物的賦形劑、中草藥 W及保健藥亦有導致肝損傷的可能。藥物引起的肝臟毒性是導致新藥研發失敗或上市后從 市場撤出的主要原因之一，據統計大約有1/3的藥物因為肝臟毒性從市場撤出。美國FDA 批準上市的藥物中，80%W上的黑框警告藥物屬于嚴重肝毒性藥物，肝毒性研究位于所有 藥物不良反應研究的首位。 雖然近年來對候選化合物或新藥的肝臟毒性早期篩查越來越引起人們的重視，但 與之相適應的快速動物篩選模型、簡單的分析檢測技術和精確的評價指標仍較匿乏。目前 在臨床前研究中，主要使用大鼠、小鼠體內實驗和人肝細胞體外實驗檢測藥物肝臟毒性。運 些檢測方法具有一定的局限性，細胞實驗不能準確反應藥物在體內微環境下的活性。哺乳 動物模型雖然具有結果可靠、綜合全面的優點，但是所需的候選物樣品量大，且耗時、耗資、 耗力，不適合高通量篩選與毒性評價研究。 近十多年來，國外的研究發現斑馬魚可用于建立多種人類疾病模型并用于藥物毒 性研究。斑馬魚的優勢在于：（1)斑馬魚全基因組測序于2009年完成，與人類基因的相似 度達87%。兩者在基因和蛋白質的序列和功能上表現很高的保守性，意味著在斑馬魚上做 藥物毒性試驗所得結果在多數情況下也適用于人體。（2)胚胎體外發育，受精后2地，主要 器官原基已形成，相當于28d的人類，實驗周期短。（3)胚胎透明，可在顯微鏡下直接觀察胚 胎發育過程，全程、完整觀察藥物對其體內器官的毒性作用，避免處死或解剖動物。（4)物種 穩定，繁殖周期短，飼養方便，費用低。斑馬魚擁有其他動物所無法相比的優點，其復制出的 疾病與人類疾病有高度相似性，具有可靠性、可控性、易行性和經濟性等特點。采用斑馬魚 進行藥物肝毒性評價不僅可減少受試藥物的用量，克服早期新藥研發中候選物樣品量不足 導致無法采用傳統的動物實驗對藥物的潛在毒性作用進行深入評價的問題，同時可在短期 內完成對化合物毒性評價與毒性機制的研究工作，明顯縮短研究周期，降低研究成本，有助 于在細胞和分子水平闡明藥物肝臟毒性作用機理。 陽0化]中國專利文獻CN(申請號201010170675. 2)公開了一種用模式生物斑馬魚篩選肝 損傷藥物的方法，但是該方法利用成年斑馬魚進行篩選，實驗周期長、所需費用高、不適合 高通量篩選。 中國專利文獻CN102353663A(申請號201110190076. 1)專利公開了一種用斑馬魚 定量評價化合物肝毒性的方法，該方法通過選定斑馬魚整個肝臟區域，計算肝臟明亮度總 和來評價化合物的肝臟毒性，但是該方法使用普通斑馬魚幼魚，體式顯微鏡下觀察肝臟與 其他臟器的界限不是完全清晰可辨，肝臟區域的選擇誤差較大，導致肝臟明亮度總和的計 算誤差大，影響實驗結果的準確性。 中國專利文獻CN104297222A(申請號201410548844.訝公開了一種斑馬魚胚胎酒 精肝檢測模型的構建方法，但是該方法未考慮到斑馬魚幼魚本身發育的個體差異問題，導 致實驗結果的誤差較大。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術的不足，提供一種快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作 用的方法，建立一種具有快速、準確、高通量特點的化合物肝臟毒性評價體系。 陽009] 本專利技術的技術方案如下： ，包括如下步驟： (1)將受精后2~4天的發育正常斑馬魚胚胎移入培養孔中； (2)對培養孔中的斑馬魚胚胎連續給藥解育1~3天，記為待測化合物組； (3)觀察斑馬魚胚胎肝臟，記錄并計算斑馬魚胚胎肝臟面積和斑馬魚胚胎體面積， 按照如下公式計算肝臟面積指數： 肝臟面積指數=肝臟面積/體面積X100 % ; (4)當步驟（3)計算的待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數不在正常斑馬 魚胚胎的肝臟面積指數的范圍內，且達到統計學上的顯著性水平（P<〇. 05)，則待測化合物 具有肝臟毒性；當步驟（3)計算的待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數在正常斑馬 魚胚胎的肝臟面積指數范圍內，則待測化合物不具有肝臟毒性； 所述的正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數為： 受精后3d的斑馬魚肝臟面積指數為0.40~0.68 %，受精后4d的斑馬魚肝臟面積 指數為1. 99~2. 66 %，受精后5d的斑馬魚肝臟面積指數為3. 07~3. 82 %，受精后6d的斑 馬魚肝臟面積指數為3. 93~4. 84%，受精后的7d斑馬魚肝臟面積指數為3. 25~4. 39%。 根據本專利技術優選的，所述斑馬魚胚胎為肝臟特異表達巧光的斑馬魚胚胎。肝臟特 異表達巧光的斑馬魚胚胎可采用本領域普通市售產品，如國家斑馬魚資源中屯、銷售的轉基 因斑馬魚。 根據本專利技術優選的，所述步驟（1)中斑馬魚胚胎為受精3~6天的斑馬魚胚胎。受 精3天W上，斑馬魚胚胎肝臟已完成發育，有利于實驗效果的準確性。 根據本專利技術優選的，所述步驟似中解育，溫度為26~30。光照解育，每天更換 含待測化合物的培養液。 根據本專利技術進一步優選的，所述培養液組分如下： NaCl5mM，KC1 0. 17mM，CaClz0. 4mM，M拆〇40. 16mM，去離子水配制。 根據本專利技術優選的，所述步驟（3)還包括觀察前的預處理步驟、；將需要觀察的斑 馬魚胚胎用質量濃度為0. 3%。的=卡因浸泡40~90s進行麻醉，然后用3%甲基纖維素固 定于載玻片上。 根據本專利技術優選的，所述步驟（3)的觀察為在巧光顯微鏡下觀察。根據本專利技術優選的，所述步驟（3)的記錄為拍照記錄。 根據本專利技術優選的，所述步驟（3)的計算為利用圖像處理軟件計算。 根據本專利技術優選的，所述步驟（2)中，待測化合物組至少做=組平行實驗，每組斑 馬魚胚胎總數不低于15枚。進一步優選的，每組斑馬魚胚胎總數為30~50枚。 陽0測原理分析 本專利技術隨機選取不同的健康斑馬魚雌雄親魚，配對產卵，收集得到不同發育階段 的斑馬魚胚胎，每組30個，按上述方法利用圖像處理軟件計算斑馬魚的肝臟面積、體面積。 根據如下公式計算各組斑馬魚的肝臟面積指數： 肝臟面積指數=肝臟面積/體面積X100%。 W31] 根據如下公式計算各組斑馬魚肝臟面積和肝臟面積指數的變異系數 (OV):C-V:=sZXX100%,,變異系數是衡量各檢測值變異程度的一個統計量，為無量綱量， 可W消除單位和（或）平均數不同對兩個或多個檢測指標變異程度比較的影響。變異系數 越小，測定結果的偏差程度越小；反之，變異系數越大，測定結果的偏差程度越大。結果發現 各組斑馬魚肝臟面積指數的變異系數均小于肝臟面積的變異系數，說明肝臟面積指數的檢 測結果比肝臟面積的檢測結果更穩定，離散度更小，精密度更高。結果如表1所示：表1不同發育階段斑馬魚的肝臟面積和肝臟面積指數的變異系數（％ )連續分批檢測不同發育階段（3化f、4化f、5化f、6化f、7化f)的斑馬魚肝臟面積、 體面積，每批30個胚胎，連續檢測5批，按上述方法中步驟（2) (3)，利用圖像處理軟件計算 斑馬魚的肝臟面積、體面積。根據如下公式計算各批次斑馬魚的肝臟面積指數：肝臟面積指 數二肝臟面積/體面積X100%。根據如下公式計算各批次間斑馬魚肝臟面積本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作用的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將受精后2～4天的發育正常斑馬魚胚胎移入培養孔中；(2)對培養孔中的斑馬魚胚胎連續給藥孵育1～3天，記為待測化合物組；(3)觀察斑馬魚胚胎肝臟，記錄并計算斑馬魚胚胎肝臟面積和斑馬魚胚胎體面積，按照如下公式計算肝臟面積指數：肝臟面積指數＝肝臟面積/體面積×100％；(4)當步驟(3)計算的待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數不在正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數的范圍內，且達到統計學上的顯著性水平(P<0.05)，則待測化合物具有肝臟毒性；當步驟(3)計算的待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數在正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數范圍內，則待測化合物不具有肝臟毒性；所述的正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數為：受精后3d的斑馬魚肝臟面積指數為0.40～0.68％，受精后4d的斑馬魚肝臟面積指數為1.99～2.66％，受精后5d的斑馬魚肝臟面積指數為3.07～3.82％，受精后6d的斑馬魚肝臟面積指數為3.93～4.84％，受精后的7d斑馬魚肝臟面積指數為3.25～4.39％。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張云，劉可春，韓利文，王雪，何秋霞，孫晨，王希敏，楚杰，韓建，王榮春，
申請(專利權)人：山東省科學院生物研究所，
類型：發明
國別省市：山東;37
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