一種檢測(cè)偽狂犬病毒GE基因的LAMP檢測(cè)方法技術(shù)

為了快速、高效地檢測(cè)豬偽狂犬病毒(PRV)，本發(fā)明專利技術(shù)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)技術(shù)建立了一種針對(duì)偽狂犬病毒的可視、靈敏、快速、特異的檢測(cè)方法。本發(fā)明專利技術(shù)提取的是臨床樣本DNA，更切合實(shí)際，只需要在65℃下恒溫反應(yīng)60min就能檢測(cè)到結(jié)果，并且具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適合基層養(yǎng)殖場(chǎng)使用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本專利技術(shù)涉及一種檢測(cè)偽狂犬病毒gE基因的 LAMP檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus，PRV)屬于痕疼病毒科，甲型痕疼病毒亞科，豬 皰疹病毒I型，線狀雙股DNA病毒。PRV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在55°C50min、80°C3min 或100°C瞬間才能將其殺滅。PRV能感染多種動(dòng)物，其中，豬是PRV的主要貯存宿主及疫源 動(dòng)物。豬偽狂犬病毒通常引起妊娠母豬繁殖功能障礙和初生仔豬神經(jīng)癥狀，仔豬感染率和 死亡率可高達(dá)100%。近年來(lái)，已有50多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了該病的發(fā)生，有分析表明該病的 流行在全球呈上升趨勢(shì)。目前，我國(guó)也有多個(gè)省份的豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了由PRV引起的一系列疾病， 這對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)模化養(yǎng)豬的不斷發(fā)展和強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，PRV 的流行日益嚴(yán)重，因此，對(duì)PRV快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展偽狂犬病毒的致病性、疫 苗免疫、診斷及分子生物學(xué)等研究具有重大意義。 目前，對(duì)PRV的抗原檢測(cè)主要依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechain reaction，PCR)，抗體檢測(cè)主要依賴酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)。PCR反應(yīng)和ELISA試驗(yàn)是 檢測(cè)偽狂犬病毒的常規(guī)方法，也是目前基層普遍使用的方法。PCR反應(yīng)一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)它可以在體外2-3小時(shí)內(nèi)，把少至幾拷貝的特 定模板DNA擴(kuò)增到原先的幾百萬(wàn)倍。其原理是先將雙鏈DNA解鏈為單鏈，引物遂與之結(jié)合， 根據(jù)堿基互補(bǔ)原則向下延伸，即可復(fù)制得到兩分子拷貝，如此不斷循環(huán)下去。PCR不僅可以 用于基因克隆和序列分析，因?yàn)樗鼣U(kuò)增放大的特點(diǎn)，在疾病診斷中也得到廣泛應(yīng)用。這項(xiàng)對(duì) 分子生物學(xué)意義重大的技術(shù)1983年由Mullis專利技術(shù)，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已成為實(shí)驗(yàn)室最常 規(guī)有效的實(shí)用技術(shù)。只是，PCR必須依靠昂貴的儀器才能得以實(shí)施，整個(gè)循環(huán)過(guò)程耗時(shí)數(shù)小 時(shí)，這對(duì)于許多條件受限的基層養(yǎng)殖戶是難以承受的，同時(shí)也無(wú)法滿足快速診斷的需要。ELISA試驗(yàn)是基于免疫酶技術(shù)發(fā)展起來(lái)的，一種對(duì)于受檢標(biāo)本的抗原或抗體進(jìn)行 定性和定量分析的生物技術(shù)。同樣地，ELISA技術(shù)也存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以在 基層養(yǎng)殖戶推廣。 2000年，Notomi等研發(fā)出一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)--環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)。LAMP是一種可對(duì)核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增 并廣泛應(yīng)用于疫病快速檢測(cè)的新型檢測(cè)方法，它是在具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶作 用下，利用能識(shí)別目的基因上6個(gè)獨(dú)立區(qū)段的4條引物，即正向內(nèi)側(cè)引物（forwardinner primer,FIP)、正向外側(cè)引物（forwardouterprimer,F3)、反向內(nèi)側(cè)引物（backwardinner primer,BIP)、反向外側(cè)引物（backwardouterprimer,B3)，在60~65°C等溫條件下高效 特異地?cái)U(kuò)增目的基因。2002年，Nagamine等在此基礎(chǔ)上添加了 2條環(huán)狀引物：上游環(huán)狀 引物（LF)和下游環(huán)狀引物（LB)，環(huán)引物的增加提高了反應(yīng)速度，縮短了反應(yīng)時(shí)間。應(yīng)用 LAMP技術(shù)，只需在60~65°C等溫條件下水浴60min即可完成目的基因的擴(kuò)增。與PCR相 比，LAMP擁有諸多優(yōu)勢(shì)，特別是整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需要水浴鍋、紫外燈這類簡(jiǎn)單的設(shè)備，適合 現(xiàn)場(chǎng)使用，且檢測(cè)時(shí)間也大大縮短。 本研究選擇提取臨床樣本DNA，目的是為了更好的切合實(shí)際，滿足養(yǎng)殖戶的實(shí)際需 要，對(duì)日后在基層中的實(shí)際推廣有著重大的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)首先涉及一種用于快速檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)引物組，所述引物組的序列結(jié)構(gòu)為：正向外引物（F3):ACGAGCCCCGCTTCCA反向外引物（B3):AGATGCAGGGCTCGTACA正向內(nèi)引物（FIP) :AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT 反向內(nèi)引物（BIP) :GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG。 所述的LAMP引物具有高度特異性，能夠在擴(kuò)增模板DNA濃度為10~101(：個(gè)拷貝 數(shù)/每ul時(shí)，有效擴(kuò)增豬偽狂犬病毒基因。 本專利技術(shù)還涉及所述的LAMP引物組在制備檢測(cè)豬偽狂犬病毒的試劑盒中的應(yīng)用。 本專利技術(shù)還涉及使用所述的LAMP引物組在檢測(cè)豬偽狂犬病毒中的應(yīng)用，所述應(yīng)用 包括如下步驟： 步驟（1)提取病料血清中的病毒DNA; 步驟⑵使用所述LAMP引物在LAMP反應(yīng)體系中擴(kuò)增病毒DNA; 步驟⑶LAMP反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)。 所述的步驟（1)的具體方法為： 1)取病料血清500yL于1.5mL離心管。向離心管中加入10%SDS溶液50yL，而 后加入蛋白酶K(20mg/mL) 10yL，混勻后置56°C水浴1. 5-2h。 2)加入200yLTris平衡酚，充分混勻溶液，置高速離心機(jī)中4°C12000rpm離心 15min〇 3)取上清液于一新1. 5mL離心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200yL，充分混 勾，4°C12000rpm離心 15min。 4)取上清液于一新離心管中，加入氯仿200yL，充分混勾，4°C12000rpm離心 15min〇 5)取上清液于一新離心管中，加入2倍上清液體積的已_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于 冰箱-20°C靜置20min后，4°C12000rpm離心15min，棄掉上清液，此時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)管底附著有透 明粘性沉淀。 6)向離心管中加入lmL70%乙醇沖洗沉淀表面和管壁，4°C7500rpm離心5min，棄 掉乙醇，用吸水紙吸走余下液體。 7)加入20yL滅菌水將沉淀溶解，置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?所述步驟（2)的具體方法為： (1) 25yL的LAMP反應(yīng)體系成分如下：1)BstDNA聚合酶（8U/yL)，lul; 2)lOXThermoPol緩沖液（100mMKC1，100mM(NH4)S04, 200mMTris-HCl，20mM MgS04, 1%TritonX-100),2. 5ul； 3)步驟⑴獲得的DNA樣品，2ul;4)MgS04 (lOOnmol/yL)，lul、Betaine(5ymol/yL)，5ul;5)dNTP(25mmol/uL)，5ul; 6)BIP&FIP引物（40uM)，2ul、F3&B3 引物（lOuM)，0? 25ul 7)余量為滅菌超純水。(2)反應(yīng)溫度控制在65°C，擴(kuò)增40-60min(優(yōu)選為60min)，80°C5min終止反應(yīng)。 所述步驟（3)的具體方法為： 1)瓊脂糖凝膠電泳、或2)SYBRGreenI染色法、或3)瞬時(shí)離心法； 所述的瓊脂糖凝膠電泳法為： 取5iiL擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳，置凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果； 所述的SYBRGreenI染色法為： 向反應(yīng)管中加入1yLSYBRGreenI核酸染料，觀察溶液顏色變化； 所述的瞬時(shí)離心法為： 在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瞬時(shí)離心，通過(guò)有無(wú)沉淀判斷反應(yīng)結(jié)果。 本專利技術(shù)還涉及所述的LAMP引本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于快速檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop?mediated?isothermal?amplification,LAMP)引物組，所述引物組的序列結(jié)構(gòu)為：正向外引物(F3)：ACGAGCCCCGCTTCCA反向外引物(B3)：AGATGCAGGGCTCGTACA正向內(nèi)引物(FIP)：AGACCACGCGCGCGGCATCAG?CTTCCACTCGCAGCTCTTCT反向內(nèi)引物(BIP)：GAGAACTTCACCGCCACGCT?CGTAGTACAGCAGGCACCG。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李俊，鄭書(shū)軒，王金寶，時(shí)建立，徐紹建，彭喆，劉暢，吳家強(qiáng)，于江，孫文博，杜以軍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37