一種方法包括：(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內(nèi)毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供樣品用于通過柱中正電性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色譜進一步純化，所述填充粒子床具有粒子間體積，(iii)將樣品體積施加到所述填充粒子床，其中所述正電性粒子支持空隙排阻色譜,并且其中所述樣品體積不大于所述粒子間體積,和(iv)洗脫包含所需蛋白和減少量的內(nèi)毒素的經(jīng)純化樣品。所述方法任選地僅利用尿囊素處理或僅利用空隙排阻色譜進行。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】【專利說明】相關(guān)申請的聲明本申請要求于2013年2月22日提交的美國臨時申請?zhí)?1/768，232的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容通過弓I用整體地結(jié)合于本文中。
技術(shù)介紹
本文公開的實施方案涉及用于減小蛋白制劑中的內(nèi)毒素水平的方法，所述蛋白制劑包括未純化的、部分純化的、和高度純化的制劑。內(nèi)毒素是源自革蘭氏陰性細菌的細胞壁的脂多糖。它們是生物制劑中普遍存在的污染物，其造成了嚴重的問題，因為它們是廣譜細胞毒素，能夠混淆研究結(jié)果，在診斷測定中得出錯誤結(jié)果，并且使得期望的治療性產(chǎn)品不能安全的使用。這使得具有將它們從其駐留的生物制劑中去除的有效材料和方法是重要的。已經(jīng)開發(fā)了許多這樣的材料和方法。已知的實例包括通過陰離子交換色譜處理制劑，在陰離子交換色譜中在許多情況下內(nèi)毒素比樣品中的所需蛋白更強力的結(jié)合(Chen, R.,等，Protein Express1n and Purificat1n 2009,64,76-81)。其他已知的實例包括輕磷灰石色譜(Gagnon, P.，等，B1Process Internat1nal 2006, 4, 50-60),固定化金屬親和色譜(Tan, L.，等，Journal of Chromatography A 2007, 1141, 226-234),利用固定化組氨酸或多粘菌素B的親和色譜(Anspach, F.，等，Journal of ChromatographyA 1995，711，81-92)，利用固定化多粘菌素B的親和色譜，利用固定化的從鱟變形細胞重組得到的內(nèi)毒素-結(jié)合肽的親和色譜(Ding, J.，等，Journal of ChromatographyB 2001，759，237-246)，利用表面活性劑 Triton X-113 的微分萃取(Cotten, M.，等，Gene Therapy 1994，1，239-246)，和大量的專有商業(yè)產(chǎn)品和方法(Kang, Y.，等，ProcessB1chemistry 2000,36,85-92) ；Salema, V.,等，Pharmaceutical Technology Europe2009, 21, 36-41) ；Clutterbuck, A.,等，B1pharm Internat1nal 2007, 20, 24-31) 0 所有這些方法利用了內(nèi)毒素的脂質(zhì)-A和核心多糖區(qū)域的特性，脂質(zhì)-A和核心多糖區(qū)域一起參與了強力的疏水相互作用)，金屬親和相互作用，和/或與帶正電荷的表面的強力的靜電相互作用。已經(jīng)記載了一種稱為空隙排阻陰離子交換(void exclus1n an1n exchange)的技術(shù)用于IgG純化，該技術(shù)也減少內(nèi)毒素含量(Nian, R.,等，J.Chromatography A1282(2013) 127-132)，與許多以前已知的方法相比其實現(xiàn)了較寬的實用性，因為它適應各種樣品，不需要它們提前平衡至特定的色譜條件，以及其實現(xiàn)緩沖液交換與去除內(nèi)毒素相結(jié)合的能力。已經(jīng)記載了一種采用過飽和尿囊素來從蛋白制劑去除內(nèi)毒素的技術(shù)，其具有耐受寬范圍的化學條件的特性，所述化學條件包括寬范圍的PH、寬范圍的鹽濃度和有機添加劑(包括表面活性劑)的存在(Vagenende, V.,等，ACS.Appl.Mater.1nterfaces5 (2013) 4472-4478 ;Vagenende, V.,等，J.Chromatography A, 1310 (2013) 127-132)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
在一些方面，本文公開的實施方案涉及這樣的方法，所述方法包括:(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內(nèi)毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供樣品用于通過柱中正電性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色譜進一步純化，所述填充粒子床具有粒子間體積，(iii)將樣品體積施加到所述填充粒子床，其中所述正電性粒子支持空隙排阻色譜，并且其中所述樣品體積不大于所述粒子間體積，和(iv)洗脫包含所需蛋白和減少量的內(nèi)毒素的經(jīng)純化樣品，其中所需蛋白駐留在平衡所述柱的緩沖液中，無論施加至所述柱的緩沖液的成分。在其他方面，本文公開的實施方案涉及這樣的方法，所述方法包括:(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內(nèi)毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供包含所需蛋白和減少量的內(nèi)毒素的樣品。還在其他方面，本文公開的實施方案涉及這樣的方法，所述方法包括:(i)提供包含所需蛋白的蛋白制劑作為具有樣品體積的樣品，所述樣品適合用于在柱中正電性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色譜，其中所述正電性粒子支持空隙排阻色譜，所述填充粒子床具有粒子間體積，并且其中所述樣品體積不大于所述粒子間體積；(ii)將所述樣品施加至所述填充粒子床，和(iii)洗脫包含所述所需蛋白和減少量的所述內(nèi)毒素的經(jīng)純化樣品。【具體實施方式】在一些實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與常規(guī)處理相比，兩步處理提供更通用和有效的內(nèi)毒素減少，所述兩步處理包括將內(nèi)毒素污染的包含所需蛋白的蛋白制劑與處于過飽和濃度的尿囊素孵育，接著以空隙排阻模式在填充的正電性粒子上進行色譜。與已知方法相反，不溶的尿囊素與內(nèi)毒素共沉淀，顯然兩者通過氫鍵鍵合。不受限于理論，與尿囊素形成氫鍵的那部分內(nèi)毒素可能包括已知為O-抗原的部分，核心多糖，或脂質(zhì)A部分。已經(jīng)指出，由于依賴于氫鍵結(jié)合，尿囊素對內(nèi)毒素的親和力不受PH、鹽濃度的寬范圍變化，或有機溶劑的存在的顯著影響。空隙排阻陰離子交換步驟可以結(jié)合內(nèi)毒素的核心多糖和脂質(zhì)-A區(qū)域。尿囊素親和性和空隙排阻步驟的組合由此潛在地靶向內(nèi)毒素分子的所有區(qū)域，這可能是雙重處理系統(tǒng)的高內(nèi)毒素去除效率的原因。方法組合還克服了通過尿囊素去除內(nèi)毒素的潛在缺點，即經(jīng)處理的樣品含有可溶的殘留尿囊素并且可能含有其他組分，包括鹽和有機添加劑，這可能干擾內(nèi)毒素減少的樣品的應用。由于空隙排阻步驟支持緩沖液交換的同步功能，并且其效力不受PH、導電率、或施加于其的蛋白制劑的其他性質(zhì)影響，在去除固體后的經(jīng)尿囊素處理的樣品可以方便地直接施加至空隙排阻柱，從空隙排阻柱所述經(jīng)尿囊素處理的樣品在平衡所述柱的緩沖液中洗脫，并且所述緩沖液可以被配制成滿足缺少內(nèi)毒素的蛋白的預期應用的要求。在許多情況下，空隙排阻步驟提供了實現(xiàn)對所需蛋白的高度純化的額外益處。然而空隙排阻步驟的基本作用仍然是增加由尿囊素所達到的內(nèi)毒素減少因數(shù)。在一些情況下，尿囊素比空隙排阻更有效地去除內(nèi)毒素；在一些情況下，該種模式是相反的，但在至今觀察到的所有情況下，除了具有上文提及的其他益處外，組合還比任一種單獨情況去除得更多。因此，在一些實施方案中，提供了一種方法，其包括:(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內(nèi)毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供樣品用于通過空隙排阻陰離子交換色譜進一步純化，(iii)將樣品體積施加到正電性粒子的填充床，其中所述正電性介質(zhì)支持空隙排阻色譜，其中所述樣品體積不大于所述填充粒子床的粒子間體積，和(iv)洗脫包含所需蛋白和減少量的內(nèi)毒素的經(jīng)純化樣品。這種采用尿囊素接著采用空隙排阻色譜的兩階段方法可以本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種方法，包括：(i)將過飽和量的尿囊素添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內(nèi)毒素；(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供樣品，該樣品用于通過在柱中的正電性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色譜進一步純化，所述填充粒子床具有粒子間體積；(iii)將樣品體積施加到所述填充粒子床，其中所述正電性粒子支持空隙排阻色譜,并且其中所述樣品體積不大于所述粒子間體積,和(iv)洗脫包含所述所需蛋白和減少量的所述內(nèi)毒素的經(jīng)純化樣品，其中洗脫的所述所需蛋白駐留在平衡所述柱的緩沖液中，而不依賴于施加至所述柱的緩沖液成分。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：彼得·斯坦利·加尼翁，文森特·瓦根尼德，
申請(專利權(quán))人：新加坡科技研究局，
類型：發(fā)明
國別省市：新加坡;SG
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