抗結(jié)腸癌黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種抗結(jié)腸癌黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉的制備方法，該方法包括以下步驟：⑴菌體發(fā)酵：黃綠蜜環(huán)菌菌種經(jīng)液體發(fā)酵、離心、減壓干燥得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物；⑵液液分配富集：黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物經(jīng)分散、萃取、減壓干燥得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位；⑶大孔樹(shù)脂柱色譜除雜：黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位溶解后經(jīng)大孔樹(shù)脂柱分離、梯度洗脫、減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉；⑷硅膠柱層析分離：黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉溶解后，經(jīng)硅膠柱色譜分離、洗脫，并經(jīng)薄層色譜檢測(cè)后減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)工藝簡(jiǎn)單、易規(guī)模化實(shí)施、質(zhì)量穩(wěn)定可控。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及藥物化學(xué)及生物醫(yī)藥
，尤其涉及。
技術(shù)介紹
黃綠蜜環(huán)菌(AraziWaria Jyieo-Kireft?)，又名黃蘑燕、黃環(huán)菌，屬擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，口蘑目，口蘑科，蜜環(huán)菌屬。野生黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、揮發(fā)油及多糖等營(yíng)養(yǎng)成分。目前，中國(guó)專(zhuān)利(CN103190279A)報(bào)道采用馬鈴薯、黃豆芽及復(fù)合VB培養(yǎng)基培養(yǎng)應(yīng)用于飲料、口服液、調(diào)味品、膳食食品及保健藥膳方面的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體，然而從黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物中規(guī)模化制備抗結(jié)腸癌浸膏粉的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝簡(jiǎn)單、易規(guī)模化實(shí)施、質(zhì)量穩(wěn)定可控的。為解決上述問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)所述的，包括以下步驟: ⑴菌體發(fā)酵:將黃綠蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵2~4個(gè)周期，每個(gè)周期7-20天，合并培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液經(jīng)離心后，得到上清液；所述上清液經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物； ⑵液液分配富集:所述黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物用其質(zhì)量10~20倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用10~20倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓干燥得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位； ⑶大孔樹(shù)脂柱色譜除雜:在所述黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位中加入其質(zhì)量5~10倍的水進(jìn)行溶解，然后經(jīng)大孔樹(shù)脂柱分離，并依次分別以水、體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液按5~10倍的柱體積進(jìn)行梯度洗脫，收集75%乙醇洗脫物；該75%乙醇洗脫物經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉； ⑷硅膠柱層析分離:在所述黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉中加入其質(zhì)量3~5倍體積分?jǐn)?shù)為90~100%的甲醇溶液進(jìn)行溶解，經(jīng)硅膠柱色譜分離后，用5~10倍柱體積的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按每份100~300 mL收集餾分，并經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，其中展開(kāi)劑為氯仿、甲醇按5:5的體積比混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為0.1-0.8的餾分；所述Rf值為0.1-0.8的餾分經(jīng)減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉。所述步驟⑴中黃綠蜜環(huán)菌菌種來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。所述步驟⑴中離心速度為3000~8000 rpm。所述減壓干燥條件是指真空度為0.07-0.09 MPa,溫度為60~70 °C。所述步驟⑶中大孔樹(shù)脂柱為AB-8型樹(shù)脂柱或X-5型樹(shù)脂柱。所述步驟⑷中氯仿-甲醇混合溶劑是指氯仿和甲醇按8:2~2:8的體積比混合而成的溶劑。如上所述的制得的黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉在制備抗結(jié)腸癌藥物或保健食品中的應(yīng)用，其特征在于:該黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉作為有效組分按常規(guī)方法與藥學(xué)上可接受的任何載體制成各類(lèi)抗結(jié)腸癌藥用制劑，或作為有效組分按常規(guī)方法與食品科學(xué)上可接受的任何載體制成各類(lèi)保健類(lèi)食品。本專(zhuān)利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn): 1、本專(zhuān)利技術(shù)采用黃綠蜜環(huán)菌菌種發(fā)酵生產(chǎn)黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物，發(fā)酵量可以按需求放大，不存在原料不足的問(wèn)題。2、本專(zhuān)利技術(shù)采用液液分配法富集黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物中乙酸乙酯萃取部位，溶劑價(jià)格低廉，而且可以再生循環(huán)使用，易于規(guī)模化。3、本專(zhuān)利技術(shù)大孔樹(shù)脂柱可以再生循環(huán)使用，同時(shí)樹(shù)脂有脫色的功效，且回收率較高。4、本專(zhuān)利技術(shù)采用硅膠柱層析分離，可直接將黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性類(lèi)組分與目標(biāo)組分分開(kāi)，同時(shí)去除部分強(qiáng)極性雜質(zhì)。5、本專(zhuān)利技術(shù)工藝簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好、質(zhì)量穩(wěn)定可控。6、本專(zhuān)利技術(shù)所獲得的黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉經(jīng)測(cè)試，具有很好的抗結(jié)腸癌的作用。⑴實(shí)驗(yàn)方法采用國(guó)際通用的MTT測(cè)定方法進(jìn)行:首先，在96孔細(xì)胞板上接種2X 14個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后；再加入不同濃度待測(cè)樣品，共設(shè)置7個(gè)藥物濃度梯度，分別為:1.0 yg/mL、5.0 yg/mL、10.0 yg/mL、20 yg/mL、30 μ g/mL、40 μ g/mL和50 μ g/mL的該黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉樣品組；72小時(shí)后，于96孔板對(duì)應(yīng)孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)3 h ;棄去96孔板中上清液，加入100 yL DMSO溶解，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光值并計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC5。。⑵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1~3組黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株均有明顯的抑制作用，依次為30.6 μ g/mL,29.4 μ g/mL,30.1 μ g/mL，平均值為30.0μ g/mL。【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1 ，包括以下步驟: ⑴菌體發(fā)酵:將黃綠蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵2個(gè)周期，每個(gè)周期20天，合并培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液經(jīng)3000 rpm的離心速度離心后，得到上清液；上清液在真空度為0.07 MPa、溫度為70 °C的條件下經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物248.2 g。其中:黃綠蜜環(huán)菌菌種來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。⑵液液分配富集:黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物用其質(zhì)量10倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用10倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液在真空度為0.07 MPa、溫度為70 °C的條件下經(jīng)減壓干燥得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位81.4 go⑶大孔樹(shù)脂柱色譜除雜:在黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位中加入其質(zhì)量5倍的水進(jìn)行溶解，然后經(jīng)大孔樹(shù)脂柱分離，并依次分別以水、體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液按5倍的柱體積進(jìn)行梯度洗脫，收集75%乙醇洗脫物；該75%乙醇洗脫物在真空度為0.07 MPa、溫度為70 °C的條件下經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉56.1g°其中:大孔樹(shù)脂柱為AB-8型樹(shù)脂柱。黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位與大孔樹(shù)脂比例為I g:50 mLo⑷硅膠柱層析分離:在黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉中加入其質(zhì)量3倍體積分?jǐn)?shù)為100%的甲醇溶液進(jìn)行溶解，經(jīng)硅膠柱色譜分離后，用5倍柱體積的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按每份100 mL收集餾分，并經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，其中展開(kāi)劑為氯仿、甲醇按5:5的體積比(mL/ mL)混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為0.1-0.8的餾分；Rf值為0.1-0.8的餾分在真空度為0.07 MPa、溫度為70 V的條件下經(jīng)減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉44.0 go其中:氯仿-甲醇混合溶劑是指氯仿和甲醇按8:2的體積比(mL/ mL)混合而成的溶劑。娃膠柱的尺寸為30 mmX60 mm。實(shí)施例2 ，包括以下步驟: ⑴菌體發(fā)酵:將黃綠蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵4個(gè)周期，每個(gè)周期7天，合并培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液經(jīng)8000 rpm的離心速度離心后，得到上清液；上清液在真空度為0.09 MPa、溫度為60 °C的條件下經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物868.5 g。其中:黃綠蜜環(huán)菌菌種來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。⑵液液分配富集:黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物用其質(zhì)量2當(dāng)前第1頁(yè)1 2 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
抗結(jié)腸癌黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉的制備方法，包括以下步驟：⑴菌體發(fā)酵：將黃綠蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵2~4個(gè)周期，每個(gè)周期7~20天，合并培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液經(jīng)離心后，得到上清液；所述上清液經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物；⑵液液分配富集：所述黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物用其質(zhì)量10~20倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用10~20倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓干燥得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位；⑶大孔樹(shù)脂柱色譜除雜：在所述黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位中加入其質(zhì)量5~10倍的水進(jìn)行溶解，然后經(jīng)大孔樹(shù)脂柱分離，并依次分別以水、體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液按5~10倍的柱體積進(jìn)行梯度洗脫，收集75%乙醇洗脫物；該75%乙醇洗脫物經(jīng)減壓干燥即得黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉；⑷硅膠柱層析分離：在所述黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粗粉中加入其質(zhì)量3~5倍體積分?jǐn)?shù)為90~100%的甲醇溶液進(jìn)行溶解，經(jīng)硅膠柱色譜分離后，用5~10倍柱體積的氯仿?甲醇混合溶劑洗脫，按每份100~300?mL收集餾分，并經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，其中展開(kāi)劑為氯仿、甲醇按5：5的體積比混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為0.1~0.8的餾分；所述Rf值為0.1~0.8的餾分經(jīng)減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的黃綠蜜環(huán)菌次生代謝產(chǎn)物浸膏粉。...

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黨軍，王啟蘭，陶燕鐸，張莉，邵赟，梅麗娟，江磊，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：青海;63