本發明專利技術公開了基于大白菜全基因組序列開發的SSR核心引物組及應用。它包括17對引物，其核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?No.1～34所示。本發明專利技術篩選出的17對SSR核心引物在大白菜基因組中分布均勻、帶型清晰容易判讀，同時適合普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測平臺和毛細管熒光檢測平臺檢測；多態性高；擴增重復性好，可用于大白菜遺傳多樣性分析、品種鑒定、DNA指紋圖譜構建等領域。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及大白菜SSR標記，具體地說是基于大白菜全基因組序列開發的SSR核 心引物組及應用，屬于分子生物學
技術介紹
大白菜是十字花科二年生草本植物，在我國北方的冬季，大白菜更是餐桌上必不 可少的，故有"冬日白菜美如筍"之說。大白菜具有較高的營養價值，有"百菜不如白菜"的 說法。大白菜中含有大量的粗纖維，可促進腸壁蠕動，幫助消化，大白菜味美清爽，開胃健 脾，含有蛋白質、脂肪、多種維生素及鈣、磷、鐵等礦物質，常食有助于增強機體免疫功能，對 減肥健美也有幫助。大白菜中的有效成分能降低人體膽固醇水平、增加血管彈性，常食可預 防動脈粥樣硬化和某些心血管疾病。因此，可以開發、加工成一系列食用方便的食品。 大白菜是我國原產蔬菜，有悠久的栽培歷史，在中國的種植面積約占蔬菜播種面 積的9 %~15 %，并且先后傳入日本、韓國、朝鮮等國家。由于大白菜在中國及東亞國家的 蔬菜生產和消費中占有舉足輕重的地位，因此大白菜新品種培育具有重要的意義。近年來， 我國大白菜新品種培育呈現良好的發展勢頭，培育出大量新品種。準確、快速進行農作物品 種的鑒定，對于農作物品種審定、品種保護、真假品種辨別、品種的產權糾紛等方面均有重 要作用。傳統的品種鑒定方法是田間種植鑒定，是將鑒定品種種植在相同的生長條件下，在 幼苗、開花期、成熟期等各個階段對多個質量性狀、數量性狀及抗病性等做出觀察記載，并 進行品種比較，鑒定品種的異同。傳統品種鑒定方法存在鑒定周期長、易受環境影響、測試 性狀多、工作量大等問題，無法適應大量品種的鑒定需求。 分子標記是以個體間核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性 的直接反映。分子標記檢測技術具有測試周期短、不受環境影響和季節限制、沒有組織特異 性、供選擇的標記數量多、可以進行高通量測試分析等優勢，已逐步用于品種鑒定、種子純 度及品種真實性檢測中。利用RAPD、AFLP、RFLP標記，可以將不同生態類型的大白菜品種 區別開。但是，RAPD重復性較差；AFLP操作較復雜，穩定性較差；RFLP操作過程繁瑣，效率 低，成本高。SSR(Simple Sequence Repeats)是以1~6個核苷酸為單位、呈串聯重復的 DNA序列，廣泛分布于真核生物基因組中。與其他分子標記相比，SSR標記具有共顯性、多態 性高、重復性好、操作簡單等優點，已經作為重要的DNA標記廣泛應用于植物遺傳多樣性研 究、品種鑒定、遺傳圖譜的構建、QTL定位、標記輔助選擇及比較基因組研究等領域。與水稻、 小麥等作物相比，現有的大白菜SSR標記數量少，不能滿足大白菜研究的需要，大量開發覆 蓋全基因組的SSR標記仍是目前大白菜研究的重要工作之一。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一套基于大白菜全基因組序列開發的SSR核心引物組，這 些引物具有擴增穩定、電泳條帶清晰、多態性豐富的優點，可有效用于大白菜遺傳多樣性分 析、品種鑒定、DNA指紋圖譜構建等研究。 本專利技術的技術方案是：基于大白菜全基因組序列開發的SSR核心引物組，其特 征是，它包括 17 對引物，分別為：CRIB1-3、CRIB2-4、CRIB2-23、CRIB3-22、CRIB3-28、 CRIB4-10、CRIB4-15、CRIB5-8、CRIB5-11、CRIB5-26、CRIB6-3、CRIB6-23、CRIB7-19、 CRIB8-5、CRIB8-12、CRIB9-3和CRIB9-8,其核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo. 1~34所 不。 上述的SSR核心引物組在大白菜遺傳多樣性分析、品種鑒定、DNA指紋圖譜構建方 面的應用。 本專利技術的有益效果：本專利技術篩選出的17對SSR核心引物（即SSR標記）在大白菜 基因組中分布均勻、帶型清晰容易判讀，同時適合普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測平臺 和毛細管熒光檢測平臺檢測；多態性高；擴增重復性好，可用于大白菜遺傳多樣性分析、品 種鑒定、DNA指紋圖譜構建等領域，有利于保護育種者、生產者和消費者的合法權益，促進大 白菜遺傳育種水平的提高和大白菜產業的發展。【附圖說明】 圖1為SSRHunterl. 3軟件搜索結果示意圖；圖2為引物在大白菜中檢測的多態性；其中A、B、C圖分別為引物CRIB6-23、CRIB5-26和CRIB9-8在大白菜中檢測的多態性，從圖中可以看出：引物的多態性最豐富且 帶型清晰； 圖3為17對引物對37個品種的聚類圖。【具體實施方式】 1.大白菜基因組DNA的提取 (1)材料37份大白菜品種（表1) 表137份大白菜品種 (2)CTAB法提取基因組DNA 采用CTAB法提取供試品種的DNA:取幼嫩組織混合樣0. 2g，放入1. 5mL離心管中， 在液氮中研碎。或將種子研碎，放入1. 5mL離心管中。將DNA提取液預熱到65°C，每管加 入400yL，混勻樣品。將離心管置于65°C金屬浴或水浴鍋中，保溫23min后取下，保溫過 程中震蕩離心管，使樣品與提取液充分混合。向離心管中加入400yL24:1氯仿-異戊醇 (V/V)，振蕩混勾。l〇〇〇〇g離心l〇min。將上清液200yL轉入另一只1.5mL離心管，加入 400yL-20°C預冷無水乙醇沉淀DNA。10000g離心lmin，棄上清液，加入500yL乙醇-乙酸 銨溶液（稱取154. 6mg乙酸銨，加入140ml無水乙醇，用去離子水定容至200mL)，6000g離心 5min收集沉淀。室溫晾干，加入100yLTE(pH8.0)溶液溶解DNA，檢測DNA濃度。-20°C 保存。 其中，DNA提取液的配方為：分別稱取20. 0g十六烷基三乙基溴化銨和81. 82g氯 化鈉放入燒杯中，然后加入40mL乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液（pH8. 0)、100mLlmol/L三羥甲 基氨基甲烷鹽酸溶液（pH8. 0)和10. 0g聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，再加入800ml去離子水， 65°C水浴中加熱溶解，冷卻后定容至1000mL。在103. 4kPa(121°C)條件下滅菌20min。于 4°C保存。 2.大白菜基因組SSR引物的開發 (1)大白菜基因組序列的獲得 大白菜全基因組測序結果從大白菜基因組數據庫Brassica Database (http:// brassicadb. org/brad/down當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
基于大白菜全基因組序列開發的SSR核心引物組，其特征是，它包括17對引物，分別為：CRIB1?3、CRIB2?4、CRIB2?23、CRIB3?22、CRIB3?28、CRIB4?10、CRIB4?15、CRIB5?8、CRIB5?11、CRIB5?26、CRIB6?3、CRIB6?23、CRIB7?19、CRIB8?5、CRIB8?12、CRIB9?3和CRIB9?8，其核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?No.1～34所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李汝玉，張晗，段麗麗，鄭永勝，王雪梅，孫加梅，王東建，李華，仙麗娜，王秀娟，王瑋，王穆穆，
申請(專利權)人：山東省農業科學院作物研究所，
類型：發明
國別省市：山東;37
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