雜交瘤細胞株ZJED0-02、抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體及其制備和應用制造技術

本發明專利技術涉及雜交瘤細胞株ZJED0-02、抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體及其制備和應用。本發明專利技術雜交瘤細胞株ZJED0-02可用于分泌抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體與博拉病毒GP蛋白的第411-490位氨基酸序列抗原肽具有高的特異性和靈敏性，可應用于制備埃博拉病毒GP蛋白檢測試劑。本發明專利技術還完成了對單克隆抗體的測序，為單克隆抗體序列的人源化改造，研發具有中和埃博拉病毒的中和抗體，為后期發展成為臨床治療埃博拉病毒病抗體奠定物質基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及雜交瘤細胞株ZJED0-02、抗埃博拉病毒GP蛋 白單克隆抗體及其制備和應用。
技術介紹
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血熱。1976年，埃博拉病毒在 扎伊爾首次暴發，后陸續在中非地區小規模暴發，截止2013年，共造成2387人發病，死亡 1310例，病死率54. 9%。2014年埃博拉病毒再次爆發，席卷西非，并跨越大洲，美國、英國、 西班牙相繼發生埃博拉病例。截止2015年5月27日，共有26969例病例，病死11135例， 病死率仍高達41. 3%。從埃博拉首次爆發至今，已經過去了將近40年，目前國際上仍然沒 有特異的治療手段和可供臨床使用的疫苗。埃博拉病毒病已經成為國際性重大傳染病，埃 博拉病毒的快速、有效診斷和治療方法的探索對埃博拉病毒病的控制以及對人類的安全至 關重要。 經典埃博拉病毒感染的診斷依賴定量PCR技術，但是在埃博拉疫源地，由于經濟 條件落后，不是每個國家和地區都能負擔相應儀器的費用，因而該診斷方法的適用范圍有 限，不能適用于全部地區。因而開發一種快速、靈敏、廉價的埃博拉病毒檢測的單克隆抗體 產品，就可以廣泛運用于疫源地，能夠更早更廣泛地發現埃博拉感染，提早進行隔離治療， 減少埃博拉病毒的擴散。 埃博拉病毒病目前仍然沒有特效的治療方法。到目前為止沒有找到一種特效的抗 埃博拉病毒藥物。雖然國際上已經研制出三種抗體混合的藥物ZMapp，但是治療效果仍然有 限且不確切。如果該抗體在臨床I期缺乏有效性和安全性，那么人們將面臨再一次無藥可 用的境地，甚至缺少了可備用的藥物。因而埃博拉單克隆抗體的繼續開發，為埃博拉病毒病 治療提供更多的備選抗體，就能大大地增大治療埃博拉病毒病的可能性。 綜上所述，發展一種快速、靈敏的埃博拉病毒診斷抗體及發展一種有望用于臨床 治療的埃博拉抗體迫在眉睫。
技術實現思路
本專利技術第一個目的是提供雜交瘤細胞株ZJED0-02,該雜交瘤細胞株已由中國典 型培養物保藏中心（CCTCC)保藏；地址：中國武漢武漢大學；保藏日期：2015年6月3日； 保藏編號為：CCTCCNO:C201584。其具有序列表中SEQIDN0:1所示的抗埃博拉病毒GP蛋 白單克隆抗體重鏈編碼基因序列（其中，1-57為前導區，58-147為框架區1，148-162為互 補決定區1，163-204為框架區2, 205-255為互補決定區2, 256-351為框架區3, 352-363為 互補決定區3,364-396為框架區4)和序列表中SEQIDN0:2所示的抗埃博拉病毒GP蛋白 單克隆抗體輕鏈編碼基因序列（其中，1-60為前導區，61-129為框架區1，130-177為互補 決定區1，178-222為框架區2, 223-243為互補決定區2, 244-339為框架區3, 340-366為互 補決定區3, 367-396為框架區4)。 本專利技術第二個目的是提供一種抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體，它是由保藏編 號為：CCTCCNO:C201584的雜交瘤細胞株ZJED0-02分泌。其重鏈氨基酸序列如序列表中 SEQIDN0:3所示，輕鏈氨基酸序列如序列表中SEQIDN0:4所示。該單克隆抗體亞型為 IgG2a、k型，與埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽具有高的特異性和靈敏性，所述抗原肽為埃博 拉病毒GP蛋白的第411-490位氨基酸序列，如SEQIDN0:5所示：ADNDSTASDTPPATTAAGPL KAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVA。 本專利技術第三個目的是提供上述抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體的制備方法，包 括如下步驟： ⑴小鼠免疫：選擇6周齡的BALB/C小鼠，以埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽（埃博 拉病毒GP蛋白的第 411-490 氨基酸序列：ADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLAITTS PQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVA)對小鼠進行免疫；每只小鼠以 100ug的抗原 肽混合佐劑后大腿內側肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次；第3次加強免疫3天后用于 融合； (2)小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養：培養小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使其保持良好 的生長狀態用于雜交瘤細胞融合； ⑶細胞融合：采用聚乙二醇細胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養 細胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞于96孔培養板，含20 %FCS的HAT培 養基培養一天，將步驟（1)中備好的小鼠處死，獲取脾臟淋巴細胞；收集步驟（2)中的小鼠 骨髓瘤細胞SP2/0,將上述兩種細胞混合離心，然后以聚乙二醇介導細胞融合，融合后的細 胞適當稀釋，接種至飼養細胞培養板，適當條件培養； (4)雜交瘤細胞的篩選：培養上述培養物，在細胞集落長到大小合適時，吸取細胞 培養上清液做抗體鑒定，篩選陽性克隆； (5)雜交瘤細胞的克隆化：以有限稀釋法克隆陽性的雜交瘤細胞，將稀釋到一定 密度的細胞接種至96孔細胞培養板，使每孔只有一個細胞生長；形成細胞集落的孔取培養 上清液做酶聯免疫吸附檢測（ELISA)，篩選和鑒定陽性克隆；重復克隆若干次，直到雜交瘤 細胞的陽性孔率達到100% ; (6)誘生腹水：在接種雜交瘤細胞前1周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只 0. 5ml，然后每只接種生長良好的5X106個陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹水離心，測定抗 體效價； (7)單克隆抗體的純化：利用ProteinG親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。 經單克隆抗體免疫球蛋白亞型分析顯示該雜交瘤細胞產生的抗體類型為IgG2a、 k型。 本專利技術第四個目的是提供雜交瘤細胞株ZJED0-02在產抗埃博拉病毒GP蛋白單克 隆抗體中的應用。本專利技術由免疫的BALB/C小鼠脾臟淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0經融 合、篩選、克隆后獲得的產生抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株ZJED0-02， 經3次克隆化，持續培養六月余，分泌抗體穩定。該細胞株經液氮凍存，復蘇后生長良好，抗 體分泌未見衰退。ELISA間接法測得ZJED0-02培養上清效價為1:320,腹水效價為1:25600。 ZJED0-02已在中國典型培養物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏號是：CCTCCNo.C201584。 本專利技術第五個目的是提供上述抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體在制備埃博拉病 毒GP蛋白檢測試劑中的應用，該檢測試劑在裝載埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培養液 中或其它產生埃博拉病毒GP蛋白的體液或培養液中檢測，通過下述途徑實現： ①以抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體為探針，用SDS-PAGE電泳通過免疫印跡方 法（WesternBlot)，對裝載埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培養液中GP蛋白的情況進行 鑒定。 ②以抗埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體作為檢測抗體，通過酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)對裝載埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培養液中GP蛋白表達水平進行定性和定 量分析。 本專利技術的有益效果： 1、本專利技術雜交瘤細胞株ZJED0-02,經3次克隆化，持續培養六本文檔來自技高網...

【技術保護點】
雜交瘤細胞株ZJED0?02，其特征在于，其保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為：CCTCC?NO：C201584。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：姚航平，吳曉鑫，吳南屏，李蘭娟，
申請(專利權)人：浙江大學醫學院附屬第一醫院，
類型：發明
國別省市：浙江;33