一種具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖的提取純化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種新的、相對(duì)安全、得率高、純度高、具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖的提取純化工藝路線，其步驟如下：龍葵粉末粉碎過篩，依次采用石油醚、乙醇脫脂，再用閃式提取，經(jīng)濃縮醇沉后，以三氯乙酸脫蛋白，活性炭脫色，二次醇沉，最后干燥制得龍葵精制多糖，得率為2.554%。該產(chǎn)物對(duì)H22肝癌細(xì)胞的體外生長具有抑制作用，1.4-1.8?mg/mL濃度時(shí)細(xì)胞抑制率35.80-85.4%，對(duì)H22荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，抑制率為37.73%?-42.60%。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬藥物提取純化
，特別是一種具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖的 提取純化方法。
技術(shù)介紹
龍葵（SolanumnigrumL.)屬前科植物，其性寒味苦，微甘，有小毒，歸肺、腎二經(jīng)。 龍葵作為傳統(tǒng)中草藥在我國各地均有分布，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、消炎利尿的功效。龍 葵多糖對(duì)肉瘤S180、胃癌MFC、宮頸癌U14等均有明顯的生長抑制作用，能夠增加免疫器官 脾臟和胸腺重量，并且能夠顯著延長荷瘤小鼠的生命周期，且無毒副作用或毒副作用明顯 低于傳統(tǒng)的化療藥物。但對(duì)龍葵多糖的研究，大多集中于粗提取物，對(duì)其精制品的分離純化 工藝的研究未見報(bào)道。 在傳統(tǒng)的方法中，多采用水為溶劑提取獲得龍葵粗多糖；但以水為溶劑提取獲得 的龍葵粗多糖仍含有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，這些成分的存在會(huì)影響藥物的質(zhì)量及安全。常用 的脫蛋白方法采用Sevag法時(shí)，效率不高，操作需反復(fù)多次，成本消耗大、毒性氯仿易殘留， 多糖易損失；采用鹽酸法時(shí)，效果雖好，但強(qiáng)酸性會(huì)使部分多糖降解，降低多糖活性；三氟 三氯乙烷法因溶劑沸點(diǎn)低易揮發(fā)不宜大量使用，采用酶法脫蛋白時(shí)會(huì)受到酶的專一性所限 制。 基于以上問題，尋找一種工藝簡單、成本低、操作方便、得率高、純度高的龍葵多糖 純化工藝方法，對(duì)于批量生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖用于開發(fā)抗腫瘤藥物尤為重 要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本專利技術(shù)針對(duì)具有抗腫瘤活性的龍葵多糖為目 標(biāo)，提供一條簡單合理、操作方便、成本低、得率高、純度高的提取純化工藝路線。本專利技術(shù)采 用石油醚及乙醇進(jìn)行脫脂，閃式提取，三氯乙酸脫蛋白，活性炭脫色，二次醇沉等方法制備 龍葵精制多糖。 本專利技術(shù)的一個(gè)目的在于提供具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖的提取純化方法。-種具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖的提取純化方法，其特征在于包括以下步 驟： (1)龍葵粗多糖樣品的制備： 龍葵飲片40-60°C干燥6_8h后，粉碎過40目篩，制得龍葵粉末；將龍葵粉末加 入4-5重量倍石油醚，于50-55°C水浴條件下，加熱回流脫脂2次，每次2h，過濾去液留渣； 將藥渣加入2倍重量的80%乙醇，于80°C水浴條件下加熱回流2次，每次lh，過濾去液留 渣，藥渣晾干，制成已脫脂的龍葵粉末；將上述已脫脂的龍葵粉末置于閃式提取儀的容器 中，加蒸餾水30重量倍，以80V電壓閃式提取2次，每次2min;合并提取液，紗布過濾，以 3000r/min離心15min，取上清液減壓濃縮至50%藥材體積，在攪拌下加入乙醇調(diào)節(jié)含醇量 至80 %，2-6°C靜置冷藏12-24h，減壓抽濾，沉淀用無水乙醇、乙醚依次洗滌2-3次后，60°C真空干燥，得龍葵粗多糖； ⑵龍葵精制多糖的純化： 將步驟（1)所得的龍葵粗多糖用蒸餾水溶解配成質(zhì)量濃度為1 %的溶液，用 3%-5%三氯乙酸溶液緩緩調(diào)節(jié)口11至2.5-3.0，振蕩處理201^11，2-6°(：靜置2-411，以300(^/ min離心lOmin去除膠狀蛋白沉淀；在上清液中加入活性炭，以稀HC1調(diào)節(jié)pH至5,40°C保溫 脫色20min，靜置lh后，以4000rpm/min離心20min除去沉淀；將上清液加入4倍量的95% 乙醇沉淀，2-6°C靜置冷藏12-24h，以4000rpm/min離心收集沉淀，用無水乙醇、乙醚依次洗 滌2-3次后，60°C真空干燥得龍葵精制多糖。 進(jìn)一步地，步驟（2)中用三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至2. 5。 步驟⑵中活性炭的加入量為待處理液量的0. 7%。 本專利技術(shù)所述龍葵飲片是指市售的經(jīng)過自然或人工干燥的中藥龍葵。 本專利技術(shù)將龍葵飲片經(jīng)過預(yù)處理、脫脂、提取、脫蛋白、脫色和醇沉的步驟，得到的龍 葵精制多糖。 本專利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供利用本專利技術(shù)的方法提取的龍葵精制多糖組分在制 備抗腫瘤藥物試劑中的應(yīng)用。 龍葵精制多糖的抗腫瘤活性作用：采用MTT法檢測利用本專利技術(shù)方法制得的龍葵精 制多糖對(duì)肝癌細(xì)胞H22體外生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，在濃度1. 4-1. 8mg/mL時(shí)細(xì)胞增殖 抑制率為35. 80-85. 4%，對(duì)H22荷瘤小鼠的腫瘤體內(nèi)生長也表現(xiàn)出明顯抑制作用，給藥劑 量在30-60mg/kg時(shí)腫瘤生長抑制率為37. 73% -42. 60%，而對(duì)荷瘤小鼠的胸腺、脾臟等免 疫器官并無不良影響。 有益技術(shù)效果 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果： (1)本專利技術(shù)設(shè)計(jì)了一條工藝簡單、操作方便、成本低、得率高、純度高的龍葵精制多 糖的提取純化工藝路線，與Sevag法、酶法脫蛋白比較，該工藝路線蛋白脫除率和多糖保留 率均較高。 (2)本專利技術(shù)在快速高效進(jìn)行閃式提取龍葵粗多糖的基礎(chǔ)上，采用三氯乙酸脫去多 糖水提液中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，采用活性炭脫除色素等雜質(zhì)，使有效成分的含量提高，有利于 后期產(chǎn)品質(zhì)量控制。 (3)本專利技術(shù)通過體外MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和小鼠移植瘤模型動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)所獲 得的龍葵精制多糖進(jìn)行了抗腫瘤活性的測定，證實(shí)經(jīng)該提取純化工藝得到的龍葵精制多糖 具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。【附圖說明】 圖1是龍葵精制多糖對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制實(shí)體圖。【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1龍葵精制多糖的制備 (1)龍葵粗多糖的提取： 預(yù)處理：稱取lOOg龍葵飲片（購自浙江嘉信醫(yī)藥有限公司）60°C下6_8h烘干，粉 碎機(jī)粉碎過40目篩。脫脂：將上述步驟的龍葵粉末加入料液比1:4的石油醚（400ml)，于50°C水浴條 件下加熱回流提取2h，共提取2次，過濾棄液留渣。在留下的渣中加入2倍量的80%乙醇 (200ml)，于80°C水浴條件下加熱回流lh，共2次，雙層紗布過濾，去液留渣，藥渣平鋪于通 風(fēng)處晾干。 多糖提取：將通風(fēng)處晾干的藥渣置于閃式提取器（JHBE-50T型閃式提取器，公司 名稱：河南金鼐科技發(fā)展有限公司）內(nèi)，加水30倍量，以提取電壓80V進(jìn)行閃式提取2min， 共2次，4層紗布過濾，濾液于3000r/min離心lOmin，得到的水提液，減壓濃縮至小體積（至 50ml)，離心取上清液。在攪拌下，向上清液中加入95%乙醇至含醇量為80%，4°C冷藏靜置 12h，虹吸上清液棄去，于3000r/min離心15min，將沉淀抽濾，分別依次用無水乙醇（100ml 左右）、乙醚（l〇〇ml左右）洗滌2次，60°C真空干燥至恒重，即得龍葵粗多糖12. 63g，得率 為 12. 63%〇 (2)龍葵精制多糖的純化：脫蛋白：龍葵粗多糖12. 63g用蒸餾水溶解配成質(zhì)量濃度為1 %的樣品液，緩緩加 入5%三氯乙酸調(diào)節(jié)pH至2. 5,振蕩處理20min，4°C靜置4h后，以3000r/min離心lOmin， 去除膠狀蛋白沉淀。 脫色：將上清液加入待處理液量的0. 7%用量的活性炭，以稀HC1(lmol/L)調(diào)節(jié)pH 至5,在40°C條件下保溫脫色20min，靜置lh后以4000rpm/min離心20min，除去活性炭沉 淀，留上清液。 醇沉：將上清液，加入4倍量的95%乙醇沉淀，2-6°(：靜置冷藏2411，以4000印111/ min離心收集沉淀，用無水乙醇、乙醚依次洗滌2-3次后，60°C真空干燥得龍葵精制多糖。 經(jīng)測定蛋白質(zhì)脫除率為90. 93%，多糖保留率為90. 83 %，精制多糖質(zhì)量為2. 554g，得率為 2. 5本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種具有抗腫瘤活性的龍葵精制多糖的提取純化方法，其特征在于包括以下步驟：???（1）龍葵粗多糖樣品的制備：龍葵飲片40?60℃干燥6?8h后，粉碎過40目篩，制得龍葵粉末；將龍葵粉末加入4?5重量倍石油醚，于50?55℃水浴條件下，加熱回流脫脂2次，每次2h，過濾去液留渣；將藥渣加入2倍重量的80%乙醇，于80℃水浴條件下加熱回流2次，每次1h，過濾去液留渣，藥渣晾干，制成已脫脂的龍葵粉末；將上述已脫脂的龍葵粉末置于閃式提取儀的容器中，加蒸餾水30重量倍，以80?V電壓閃式提取2次，每次2min；合并提取液，紗布過濾，以3000?r/min離心15?min，取上清液減壓濃縮至50%藥材體積，在攪拌下加入乙醇調(diào)節(jié)含醇量至80%，2?6℃靜置冷藏12?24h，減壓抽濾，沉淀用無水乙醇、乙醚依次洗滌2?3次后，60℃真空干燥，得龍葵粗多糖；（2）龍葵精制多糖的純化：將步驟（1）所得的龍葵粗多糖用蒸餾水溶解配成質(zhì)量濃度為1%的溶液，用3%?5%三氯乙酸溶液緩緩調(diào)節(jié)pH至2.5?3.0，振蕩處理20?min，2?6℃靜置2?4h，以3000r/min離心10min去除膠狀蛋白沉淀；在上清液中加入活性炭，以稀HCl調(diào)節(jié)pH至5，40℃保溫脫色20?min，靜置1h后，以4000?rpm/min離心20min除去沉淀；將上清液加入4倍量的95%乙醇沉淀，2?6℃靜置冷藏12?24h，以4000rpm/min離心收集沉淀，用無水乙醇、乙醚依次洗滌2?3次后，60℃真空干燥得龍葵精制多糖。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃越燕，朱琦峰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：嘉興學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33