錳超氧化物歧化酶SOD2的體外分子檢測方法及引物技術

本發明專利技術涉及一種錳超氧化物歧化酶SOD2的體外分子檢測方法及引物，⑴目標組織或細胞中總RNA的提取：⑵采用步驟⑴提取出的RNA進行逆轉錄PCR，獲得模板RNA；⑶采用權利要求1所述的引物，以及步驟⑵的模板RNA進行實時熒光定量PCR。本發明專利技術開發一種以熒光定量PCR檢測為主的相對定量檢測試劑盒，也可以穩定、特異、準確的檢測出人的不同組織、細胞中SOD2基因的表達量差異，且有極高的重復性。克服了市場上常用酶活檢測試劑盒的人為因素影響大、穩定性差、重復性差等因素。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學領域，主要應用于生物體外實驗，和臨床體外診斷，尤其是 一種錳超氧化物歧化酶S0D2的體外分子檢測方法及引物。 技術背景 S0D是Super Oxide Dismutase縮寫，中文名稱超氧化物歧化酶，是生物體內重要 的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內，如動物，植物，微生物等。S0D具有特殊的生理活性， 是生物體內清除自由基的首要物質。S0D在生物體內的水平高低意味著衰老與死亡的直觀 指標；現已證實，由氧自由基引發的疾病多達60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞 造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。由于現代生活壓力， 環境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成。 S0D常用于對缺血、出血性心、腦等重要臟器病傷（或手術治療后）引發的繼發性 (自由基）過氧化損傷及其自由基清除藥物治療效果的監測，以指導臨床制定相應的自由 基清除干預對策及最佳治療時間窗的確立，它對自由基繼發損傷病情的診斷、自由基清除 治療療效跟蹤和預后判斷與評估等具有重要參考價值。比較一致的意見是：S0D測定雖然 是一種非特異的輔助診斷指標，但對機體自由基代謝紊亂、自由基清除干預對策、以及對于 同一病患者病程轉歸（自由基損傷的加劇或降低、自由基清除劑藥物或手術治療效果）的 判斷，實時動態監測具有重要參考價值。 S0D2是S0D家族的一種，目前目前體外的S0D的檢測方法主要集中在蛋白質與蛋 白質互作的elisa法和酶競爭法，此方法可以檢測酶的活性，但是由于樣品蛋白質認為操 作因素導致誤差大，且蛋白質不穩定，極易降解和變性，導致活性下降和失活。結果的可信 度大打折扣。且檢測是檢測所有的S0D，無法具體區分S0D2中的具體含量。 目前市場還尚未發現有關分子檢測S0D2的試劑盒，此專利技術對未來S0D2更加精確 應用到臨床等領域提供了強有力的分子檢測基礎。 CN102095856A公開了一種超氧化物歧化酶快速檢測卡及其檢測方法，在長條扁平 薄殼狀的檢測卡外殼中設置測試條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；測試條是由支 承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、膠體金膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成； 支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣 品墊，吸水膜內端與樣品墊內端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜 的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段膠體金膜；膠體金膜為含抗超氧化物歧化酶抗體膠體金 標記的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測帶和一條質控帶，依次是：含超氧化物歧化 酶的檢測帶，含抗兔抗體或抗鼠抗體的質控帶，測試條置入檢測卡外殼內，樣品墊正對加樣 孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。 目前市場還尚未發現有關S0D2的分子水平檢測試劑盒，本專利技術對未來分子檢測 S0D提供了強有力的基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種人體內鋅銅超氧化物歧化 酶S0D2表達量的體外分子檢測方法及所用的引物，本方法可以在體外檢測人體不同組織、 細胞受到的氧化損傷程度的相對大小，可應用于體外基因分子診斷等方面。 本法實現目的的技術方案如下： -種錳超氧化物歧化酶S0D2的體外分子檢測引物，正向引物序列見序列1，反向 引物序列見序列2。 與錳超氧化物歧化酶S0D2的體外分子檢測引物配合使用的內參引物，正向引物 序列見序列3,反向引物序列見序列4。 -種錳超氧化物歧化酶S0D2的體外分子檢測方法，步驟如下 ⑴目標組織或細胞中總RNA的提取： ⑵采用步驟⑴提取出的RNA進行逆轉錄PCR，獲得模板RNA ; ⑶采用錳超氧化物歧化酶S0D2的體外分子檢測引物，正向引物序列見序列1，反 向引物序列見序列2,以及步驟⑵的模板RNA進行實時熒光定量PCR。 本專利技術的優點和積極效果： 本專利技術開發一種以熒光定量PCR檢測為主的相對定量檢測試劑盒，也可以穩定、 特異、準確的檢測出人的不同組織、細胞中S0D2基因的表達量差異，且有極高的重復性。克 服了市場上常用酶活檢測試劑盒的人為因素影響大、穩定性差、重復性差等因素。在醫療檢 測和化妝品抗衰老領域，配合大量臨床實驗數據的基礎上，可以早期判斷由于S0D2酶表達 量高低反映相關疾病的情況，對疾病的早期治療和預防起到積極的作用。目前市場上還未 出現關于S0D2的檢測產品，尤其是分子生物學檢測的方法，有利于推動S0D分子檢測市場 的發展。【附圖說明】 圖1為本專利技術GAPDH、S0D2擴增基因瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2為本專利技術引物特異性； 圖3為本專利技術qPCR反應性靈敏性； 圖4為本專利技術結果分析5種不同濃度雙氧水處理人皮膚細胞后的S0D2表達量差 異柱狀圖； 圖5標準曲線。橫坐標為拷貝數lg值，眾坐標為Cq值。 具體的實施方式 為了理解本專利技術，下面結合實施例對本專利技術作進一步說明：下述實施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本專利技術的保護范圍。 本方法中熒光定量PCR引物的設計，首先，根據RNA序列號：NM_001024465. 1正反 向引物均是跨基因組內含子設計，避免了由于樣品中殘留的基因組DNA的污染，而導致結 果的準確度低和重復性差的缺點，提高了特異性和結果的準確度。其次，使用NCBIblast比 較，與使用PRMER5. 0設計軟件分析，優化引物，將發各項指征均控制在最優范圍之內，極 大程度降低了引物二聚體的形成。將引物長度達到較高的25bp，在一定程度上也提高了擴 增的特異性。無需加入DNase處理，同時采用sybergreen法，同探針法相比節省了一定的 成本。 具體實驗過程如下： -、以人皮膚細胞（HSF)體外培養，給5種不同濃度的雙氧水處理為例； 1、將HSF細胞鋪于2個六孔板的10個孔之中，每孔數量控制在80000,每孔含1ml 的高糖DMEM培養基，含10%的胎牛血清，放置于C02培養箱37°C培養24h使其正常貼壁。當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種錳超氧化物歧化酶SOD2的體外分子檢測引物，其特征在于：正向引物序列見序列1，反向引物序列見序列2。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫麟，馬潔，劉宇，
申請(專利權)人：天津市康婷生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12