本發明專利技術的領域涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法，其具體為，超濾并濃縮肺炎鏈球菌溶解產物，加入脫氧膽酸鈉，調節pH至4-5，離心處理取上清液,加入核酸酶反應3-8小時,得到酸化溶解產物,加入脫氧膽酸鈉，超濾酸化溶解產物,酸化后離心處理取上清液；超濾濃縮獲得純化多糖溶液多糖。該方法未使用苯酚及乙醇干燥后得到純化的肺炎鏈球菌莢膜只使用一次核酸酶處理細胞溶解產物，產品更安全環保，工藝時間短，生產成本低，可實現大規模生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術的領域涉及，尤其涉及一種簡化的純 化方法。
技術介紹
肺炎鏈球菌是呼吸道感染的首要致病菌，既是引起兒童社區獲得性肺炎最常見的 病原菌，也是致使老年人致命性肺炎感染的主要病原菌。目前發現90余個血清型，其中約 30個血清型的菌株對人類有致病性。莢膜多糖是肺炎鏈球菌的主要毒力因子，研究結果表 明肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。制備肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗一般過程為：細菌在發酵罐中生長，在發酵結束時 通過加入脫氧膽酸鈉或者另外的裂解劑誘導裂解。然后收獲裂解物以進行下游的純化并回 收圍繞細菌細胞的莢膜多糖。所述多糖包含于最終的疫苗產物中，并賦予疫苗靶向群體對 于選定的肺炎鏈球菌血清型的免疫力。 在發酵培養過程中，除了產生莢膜多糖之外，還產生大量的蛋白質、核酸等成分， 當疫苗中含有這些成分且含量超過一定標準時，接種后可能導致較嚴重的副反應。《歐洲藥 典》肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗規程對莢膜多糖中的蛋白質含量、核酸含量和特異多糖含量 有嚴格的要求。 肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法已有諸多報道和研究，但仍存在一些不足。例如， EP8026320中描述了一種經典的肺炎鏈球菌莢膜多糖純化方法，即肺炎鏈球菌發酵培養液 經脫氧膽酸鈉裂解后，離心超濾濃縮，用乙醇進行兩步分級沉淀，再用苯酚抽提法去除蛋白 質，用活性炭吸附法去除核酸。該方法步驟繁瑣，耗時較多，所用試劑中含有有毒的苯酚，對 人體及環境均有危害。另外，乙醇的使用在操作和試劑保存方面均存在重大安全隱患。US4242501、US4686102將此方法進行了改進，用溴化十六烷基三甲銨 (CTAB)替代了苯酚，但仍然沒有避免乙醇的使用。US20100129881和NormaSuarez 等人（NORMASUA，REZ,LAURAFRANCO,etal.，FRAGUASAPPLIEDANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2001，p. 969 - 971Vol. 67,No. 2)，在肺炎鏈球菌莢膜多糖純化工藝中引 入了柱層析的方法，但該方法對操作人員的要求較高，樣品處理時間較長，且設備的運 行及維護費用高昂，很難滿足大規模生產的需求。CA1206905提出了酶解法純化肺炎 鏈球菌莢膜多糖，VivianeMaimoniGOftQalveS(VivianeMaimoniGor^alves,et al. ,Simpleandefficientmethodofbacterialpolysaccharidespurification forvaccinesproductionusinghydrolyticenzymesandtangentialflow ultrafiltration,CommunicatingCurrentResearchandEducationalTopicsand TrendsinAppliedMicrobiology, 2007, 1 (13) :450 - 457；VivianeMaimoniGongaives； etal. ,PurificationofCapsularpolysaccharidesformstreptococcuspneumoniae serotype23Fbyaproceduresuitableforscale-up,Biotechnol.Appl. Biochem.，2003, 37(3) : 283 - 287)等人，又做了一些改進，但這些方法均需使用多種核酸 酶、蛋白酶，步驟較多，成本較高，而且仍需乙醇分級沉淀處理，存在安全隱患。
技術實現思路
本專利技術針對以上問題，提供了一種更為簡單，成本更低的純化方法。 本專利技術的在于提供，其含有以下步驟： (a)細胞裂解 提供包含可產生選定肺炎鏈球菌血清型的細菌細胞的發酵培養液； 加入脫氧膽酸鈉溶解所述步驟中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、 核酸和多糖的細胞溶解產物；使用離心處理細胞溶解產物，取上清； 對上清液進行超濾濃縮，以去除低分子量雜質并濃縮，由此產生第一澄清細胞溶 解產物； (b)脫氧膽酸鈉處理 在步驟（a)第一澄清細胞溶解產物中加入脫氧膽酸鈉，并將pH降低至4-5以使蛋 白質和/或核酸沉淀，離心處理取上清液，得到酸化溶解產物； 重復1-2次，獲得進一步純化的酸化溶解產物； 對進一步純化的的酸化溶解產物進行超濾濃縮，以去除低分子量雜質并濃縮，以 獲得第二澄清細胞溶解產物； (c)核酸酶處理 使用核酸酶處理所述步驟（b)中的第二澄清細胞溶解產物； 在核酸酶處理的細胞溶解產物中加入脫氧膽酸鈉，并將pH降低至4-5以使蛋白質 和/或核酸沉淀，離心處理取上清液； 對上清液進行超濾濃縮，以去除低分子量雜質并濃縮，從而獲得純化多糖溶液。 其中，前述純化多糖溶液可通過干燥步驟進行干燥，所述的干燥步驟可為包括噴 霧干燥、流化床（fluidizedbed)干燥、轉鼓式干燥、真空冷凍干燥在內的常見干燥方式，但 是出于便捷、以及純化多糖溶液的穩定性考慮，優選地采取真空冷凍干燥。 其中，前述步驟（a)，（b)，（c)中的超濾濃縮是指用截留分子量為100Kd_300Kd的 超濾膜超濾濃縮。 其中，前述步驟（a)中的脫氧膽酸鈉為終濃度為0. 05-0. 2%的脫氧膽酸鈉，前述 步驟（b)，（c)中的脫氧膽酸鈉為終濃度為0. 2-3%的脫氧膽酸鈉。需要說明的是，由于在步 驟（b)中，脫氧膽酸鈉的添加量可能分多次重復加入，而此處說明的終濃度含量，是在多次 重復添加后的最終濃度含量，且該濃度百分比為質量百分比。 其中，前述步驟（a)中的脫氧膽酸鈉的處理時間為12-15小時，溫度為18~22°C; 所述步驟（b)，（c)中的脫氧膽酸鈉處理時間為8-15分鐘，溫度為18~22°C。 其中，前述步驟（a), (b)，（c)中的離心過程中的離心力為6000g，離心時間為15~ 35分鐘。 其中，步驟（c)中的核酸酶為脫氧核糖核酸酶I(Sigma公司，貨號：DN25,批號： SLBC4924V)〇 其中，步驟（c)中的核酸酶處理還混合有CaCl2,MgCl2。 其中，步驟（c)中的核酸酶處理時間為3-8小時，溫度為35_37°C。 本方法的優勢為：1.避免苯酚的使用，產品更安全環保；2.無乙醇的純化工藝，消 除了安全隱患；3.只使用一次核酸酶，縮短了工藝時間，降低了生產成本；4.工藝操作簡 便，可實現大規模放大。 下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料或生 物制劑，如無特殊說明，均為可從市場上購得的常規試劑。以下實施例中的定量實驗，均設 置三次重復實驗，結果取平均值?！揪唧w實施方式】 實施例1 :1型肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化 1型肺炎球菌發酵培養液5L，加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0.15%，置于室溫下 裂解12小時。隨后將裂解液離心（離心力：6000g，離心時間：35分鐘），收取上清液。隨 后將該上清液通過l〇〇Kd膜包超濾濃縮至1000ml。加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0. 5%， 調口11至4.4，室溫靜置10分鐘，進行離心（離心力：600(^，離心時間：15分鐘），收集上清 液。隨后重復前述步驟，再加入0. 5 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種自肺炎鏈球菌中純化莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟：(a)細胞裂解提供包含可產生選定肺炎鏈球菌血清型的細菌細胞的發酵培養液；加入脫氧膽酸鈉溶解所述步驟(a)中的細菌細胞；使用離心處理細胞溶解產物，取上清液；對上清液進行超濾濃縮，由此產生第一澄清細胞溶解產物；(b)脫氧膽酸鈉處理在步驟(a)第一澄清細胞溶解產物中加入脫氧膽酸鈉，并將pH降低至4?5，離心處理取上清液，得到酸化溶解產物；重復1?2次,獲得進一步純化的酸化溶解產物；對進一步純化的酸化溶解產物進行超濾濃縮，以獲得第二澄清細胞溶解產物；(c)核酸酶處理使用核酸酶處理所述步驟(b)中的第二澄清細胞溶解產物；在核酸酶處理的細胞溶解產物中加入脫氧膽酸鈉，并將pH降低至4?5，離心處理取上清液；對上清液進行超濾濃縮，獲得純化多糖溶液。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：任克明，王璽，王劍虹，白貴杰，沈榮，
申請(專利權)人：蘭州生物制品研究所有限責任公司，
類型：發明
國別省市：甘肅;62
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