本發明專利技術涉及一種提高MiDGAT1在啤酒酵母中的三酰甘油合成能力的多肽及其用途。具體地，本發明專利技術克隆獲得一種新的DGAT基因，命名為MiDGAT1，并獲得一種新的PH結構域序列，通過基因功能互補實驗，發現MiDGAT1和MiDGAT1-ΔPH編碼的蛋白都具有合成TAG的能力，但通過半定量薄層色譜方法發現MiDGAT1酵母合成的TAG含量要比MiDGAT1-ΔPH酵母高得多，從而證明了PH結構域序列能增強MiDGAT1在酵母中合成TAG的能力，且其增強作用顯著強于現有技術中的PH結構域序列。據此可將含有本發明專利技術PH結構域的MiDGAT1在油料等作物中表達以顯著增加三酰甘油的產量。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程
，具體地說，涉及缺刻緣綠藻二酰甘油酰基轉移酶 1 (MiDGATI)中的 Pleckstrin 同源性（Pleckstrin Homology，PH)結構域（domain)序列及 功能鑒定。
技術介紹
當今世界，隨著人類對各種礦產資源，如煤、石油、天然氣等利用的不斷耗盡，人類 急于尋找新的能源來源，特別是可再生資源。生物柴油，特別是微藻生物柴油，是一種可再 生資源，是人類急于尋找和探索的新能源之一，也是近年科學家研究的熱點之一。與傳統的 生物柴油的原料相比，例如植物油脂和動物脂肪，微藻具有生長快、生物量豐富、含油量高 和不占用土地等非常多的優勢。缺刻緣綠藻（Myrmecia incisa Reisigl H4301)是一種淡 水單細胞微藻，隸屬綠藻門（Chlorophyta)。該藻在氮饑餓脅迫下能大量積累花生四烯酸 (ArA)，且在細胞中是以三酰甘油（TAG)的形式儲存在油滴中。因此，該藻是潛在的生產微 藻生物柴油藻種。 微藻生物柴油主要來自于存儲脂類，其中最重要的一類就是TAG。TAG是一類中性 脂質，代表了真核細胞中最重要的能量存儲形式。在許多植物中，TAG常積聚在種子中，但 花瓣、花粉和果實也能存儲TAG。TAG是人類消費的主要可再生資源，除了食用，它們也被用 來生產油漆、洗滌劑、潤滑劑、生物燃料和尼龍等方面。 TAG的合成主要是通過各種酶沿著肯尼迪途徑（Kennedy pathway)來完成的，這 些酶依次把酰基輔酶A的酰基鏈轉移到甘油骨架的sn-l、sn-2和sn-3位置。酰基輔酶A : 二酰基甘油酰基轉移酶（DGAT，EC 2. 3. 1. 20)是一種具有催化活性的跨膜蛋白，作用于TAG 生物合成的最后步驟。它以酰基輔酶A為底物，催化并使sn-l，2-二酰基甘油（DAG)的sn-3 位酰化，從而形成TAG。因此，DGAT被認為是TAG生物合成的關鍵酶，它有可能被用來增加 含油植物的含油量。目前，研究發現了 3種類型的DGAT，即DGATUDGAT2和DGAT3,且表明， DGAT1和DGAT2是負責TAG合成的，而DGAT3被證明是參與了角質的生物合成。在很多高等 植物中雖然已經證明了 DGAT1具有TAG的合成功能，但是對微藻DGAT1合成TAG的功能研 究還是比較少的，目前只在三角褐脂藻（Phaeodactylum tricornutum)中有報道，但有關藻 類DGAT1中PH結構域的功能研究還未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中的不足，提供一種多肽。 本專利技術的再一的目的是，提供一種分離的核苷酸序列。 本專利技術的另一的目的是，提供一種重組表達載體。 本專利技術的第四個目的是，提供一種基因工程化的宿主細胞。 本專利技術的第五個目的是，提供上述多肽、核苷酸序列、重組表達載體或宿主細胞的 用途。 為實現上述第一個目的，本專利技術采取的技術方案是： -種多肽，所述多肽的氨基酸序列選自： a) SEQIDN0:26的第47-153位置所示的氨基酸序列；或 b)SEQIDN0:26所示的氨基酸序列。 為實現上述第二個目的，本專利技術采取的技術方案是： -種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列選自下列中的任一種： a) SEQIDN0:14的第408-728位置所示的核苷酸序列； b)SEQIDN0. 14所示的核苷酸序列； c)SEQIDN0. 25所示的核苷酸序列。 為實現上述第三個目的，本專利技術采取的技術方案是： -種重組表達載體，所述的重組表達載體是由如上所述的核苷酸序列與質粒或病 毒所構建的重組表達載體。 優選地，所述的質粒是pYES2質粒。 為實現上述第四個目的，本專利技術采取的技術方案是： -種基因工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞選自于下列中的一種： a)用如上所述的核苷酸序列轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞； b)用如上任一所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞。 優選地，所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿 主細胞的后代。 更優選地，所述的宿主細胞是酵母細胞。 為實現上述第五個目的，本專利技術采取的技術方案是： 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上任一所述的重組表達載體、或如上 任一所述的宿主細胞在生產三酰甘油中的用途。本專利技術優點在于： 本申請專利技術人克隆獲得一種新的DGAT基因，命名為MiDGATl，其編碼的蛋白與這 2 種藻(Auxenochlorella protothecoides， GenBank ID：KFM28983 ；Tetraselmis sp.，GenBank ID:JAC66181)的DGAT1氨基酸相似性均達40%。同時，新奇地發現MiDGATl編碼 的蛋白含有一個PH結構域，該結構域由107個氨基酸殘基構成，且與藻類Auxenochlorella protothecoides(GenBank ID :KFM28983)的PH結構域（由97個氨基酸殘基構成）氨基酸 相似性為42%。據此，專利技術人在已報道的藻類DGAT研究中搜索，還沒有發現關于藻類DGAT1 中PH結構域的功能性研究報道。進而，專利技術人探討了該PH結構域序列在MiDGATl合成 TAG過程中的作用。通過將編碼PH結構域的cDNA片段從MiDGATl基因中切除，將剩余部 分（命名為MiDGATl- A PH)和MiDGATl分別轉入到TAG合成缺陷啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株H1246中表達，即進行基因功能互補實驗，發現MiDGATl和MiDGATl- A PH 編碼的蛋白都具有合成TAG的能力，但通過半定量薄層色譜方法發現MiDGATl酵母合成的 TAG含量要比MiDGATl- A PH酵母高得多，從而證明了 PH結構域序列能增強MiDGATl在酵母 中合成TAG的能力。據此可將含有該PH結構域的MiDGATl在油料等作物中表達以顯著增 加三酰甘油的產量。【附圖說明】 圖1.缺刻緣綠藻MiDGATl基因結構示意圖。灰色線是非翻譯區，黑色線為內含子， 黑色框為外顯子。圖2?酵母細胞的Bodipy染色圖片。其中MiDGAT2A(ZL201210477507. 7)、 MiDGAT2B(ZL201310668330. 3)是本實驗室已申請的2件專利技術專利涉及的DGAT，在此作為參 照。 圖3.酵母油脂的TLC圖譜。從左道到右道依次為MiDGATl- A PH、TAG標準品（英 國Nu-Chek公司）、MiDGATl、MiDGAT2A、MiDGAT2B、野生型酵母Scy62、缺陷株H1246、攜帶 PYES2的缺陷株。【具體實施方式】 下面結合附圖對本專利技術提供的【具體實施方式】作詳細說明。 本專利技術的主要技術路線為： (1)將缺刻緣綠藻接種于BG-11培養基的三角錐形瓶中，置于溫度為25°C、光照強 度為115 ymol photons ? m 2 ? s \光照周期為光照：黑暗/12h: 12h的培養箱中培養，每天 定期搖晃數次。收集藻體細胞，并提取基因組總RNA和DNA。 (2)基于缺刻緣綠藻轉錄組庫，通過同源性搜索和基因注釋，得到了 2條分別長 378bp (編號為 fu-G62本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列選自：a)SEQ?ID?NO:26的第47?153位置所示的氨基酸序列；或b)SEQ?ID?NO:26所示的氨基酸序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：周志剛，陳春秀，
申請(專利權)人：上海海洋大學，
類型：發明
國別省市：上海;31
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