免疫球蛋白融合蛋白制造技術

本發明專利技術公開包括生物活性分子和連接到生物活性分子的免疫球蛋白(Ig)Fc結構域的融合蛋白。該Fc結構域是(i)IgG1、IgG2或IgG4，或(ii)IgG4和IgD的雜交人Fc結構域。該雜交Fc用作生物活性分子的載體。

【技術實現步驟摘要】
免疫球蛋白融合蛋白本申請是申請日為2008年5月30日、申請號為200880016313.9、題為“免疫球蛋白融合蛋白”的專利申請的分案申請。
本專利技術涉及雜交人Fc和免疫球蛋白融合蛋白，在其中雜交人Fc連接到生物活性分子。具體地，它涉及雜交人Fc，其源于人免疫球蛋白G(IgG)亞類的組合或人IgD和IgG的組合；以及融合蛋白，在其中這種Fc經共價鍵偶聯到生物活性分子。
技術介紹
生物活性分子在治療上可以具有很大的優勢。但是，它們作為治療劑可能具有缺點，因為它們具有較低的體內穩定性。它們具有較短的循環半衰期或血清半衰期，因為它們被活體內各種酶消化。因此，一直期望提高生物活性分子的循環半衰期。已知：增加蛋白質大小，通過阻止經腎去除蛋白質可以增加它的半衰期(Knauf等，J.Biol.Chem.1988.263：15064-15070)。例如，已經報道通過將活性蛋白偶聯到人白蛋白可增加蛋白質穩定性(Kinstler等，Pharm.Res.1995.12：1883-1888)。但是，由于活性蛋白至人白蛋白的偶聯只是略微增加它的滯留期，因此發展含有偶聯到人白蛋白的活性蛋白的有效藥物制劑不是有效方法。其它報道的方法是調整蛋白質的糖基化。在蛋白質上增加糖基化和將唾液酸引入蛋白質可防止肝中蛋白質的降解。但是，蛋白質糖基化的增加也導致了蛋白質活性的降低。為了穩定蛋白質和防止經腎的清除，將蛋白質連接到聚乙二醇(PEG)。共價連接到PEG已經被廣泛使用以遞送具有延長的半衰期的藥物(Delgado等，1992.9：249-304)。但是，已經報道PEG連接到細胞因子或激素導致受體結合親和力的降低，原因在于該連接所引起的位阻。最近，已經研究和發展了使用免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)制備的融合蛋白。Ig是血液的主要成分。人Ig(humanIg，hIg)包括不同種類，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE(Roitt等，“Immunology”1989，GowerMedicalPublishing，London，U.K.；NewYork，N.Y.)。人IgGs可以進一步分為各種亞型，其已知為人IgG1(hIgG1)、人IgG2(hIgG2)、人IgG3(hIgG3)和人IgG4(hIgG4)。免疫球蛋白由四條多肽鏈組成，兩條重鏈和兩條輕鏈，它們經過二硫鍵形成四聚體。每條鏈由可變區和恒定區組成。基于同種型(isotypes)，重鏈的恒定區進一步地分成三個或四個區(CH1、CH2、CH3和CH4)。基于Ig同種型，重鏈恒定區的Fc部分包括鉸合部、CH2、CH3和/或CH4結構域。關于血清半衰期，IgG1、IgG2和IgG4具有21天的長半衰期，而其它免疫球蛋白具有小于一周的相對短的半衰期。融合到IgG的Fc部分的嵌合蛋白質顯示增加的穩定性和增加的血清半衰期(Capon等，Nature1989.337：525-531)。生物活性蛋白已融合在CH1區域的N-端、Fc區域的N-端或IgGCH3區域的C-端。在開始期，用細胞表面受體例如CD4(Capon等，Nature1989.337：525-531)、TNFR(Mohler等，J.Immunology1993.151：1548-1561)、CTLA4(Linsley等，J.Exp.Med.1991.173：721-730)、CD86(Morton等，J.Immunology1996.156：1047-1054)的胞外結構域產生IgG融合蛋白。同時，存在幾種已融合到IgG結構域的細胞因子和生長激素。但是，與用細胞表面受體的胞外結構域的融合不同，與非融合細胞因子或生長因子相比，用可溶性蛋白質融合到IgG導致生物活性的降低。嵌合蛋白質作為二聚體存在，其導致由于與它們的靶分子類似受體的相互作用而的位阻，原因在于彼此靠得很近的兩種活性蛋白質的存在。因此，這個問題應該被克服以產生有效的融合蛋白。Fc融合技術的其它限制是存在不期望的免疫反應。免疫球蛋白的Fc結構域同時具有效應子功能例如抗體依賴的細胞介導細胞毒反應(antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)或補體依賴性細胞毒(complement-dependentcytotoxicity，CDC)。這種效應子功能一般經過Ig的Fc區域與在效應細胞上FcRs的相互作用或經過補體結合取得。因此，應該進行Fc的效應子功能的阻斷以減少不期望的反應例如細胞殺死、細胞因子釋放或炎癥。專利技術公開技術問題總的說來，有對具有生物活性的最小損失和具有不期望的免疫反應的最小風險的改良Fc融合蛋白的需求。技術方案本專利技術提供雜交Fc(雜合Fc)，其源于人IgG亞類的組合或人IgD和IgG的組合。當雜交Fc連接到生物活性分子時，雜交Fc有效增加了生物活性分子的血清半衰期，以及當編碼Fc-多肽融合蛋白的核苷酸被表達時，增加了多肽的表達水平。本專利技術同時提供在其中雜交Fc連接到生物活性分子的雜交Fc融合多肽。該融合蛋白有時稱為“生物活性分子-Fc融合蛋白”或簡稱為“融合蛋白”。該融合蛋白可以具有Fc和生物活性分子之間的連接體。Fc可以在其N一端偶聯到生物活性分子的C-端。可通過如下步驟產生融合蛋白：構建編碼和能夠表達融合蛋白的核苷酸；在宿主細胞中表達它；和收獲融合蛋白。可選地，該融合蛋白可以通過表達編碼Fc的核苷酸，并以常規方式將它連接到生物活性分子而產生。根據本專利技術的一種實施方式的多肽可以用下式表示：N′-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C′其中N′是多肽的N-端和C′是多肽的C-端；Z1表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO：11的90到98位置的氨基酸殘基的至少C-端部分或在SEQIDNO：14的90-98位置的氨基酸殘基的至少一部分；Y表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO：11的99到113位置的氨基酸殘基的至少C-端部分或在SEQIDNO：14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分；Z2表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO：12的111到147位置的氨基酸殘基的至少N-端部分或在SEQIDNO：14的163到199位置的氨基酸殘基的至少一部分；Z3表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO：11的118-223、SEQIDNO：12的114-219、SEQIDNO：24的165-270或SEQIDNO：13的115到220位置的氨基酸殘基的至少C-端部分；Z4表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO：11的224-330、SEQIDNO：12的220-326、SEQIDNO：24的271-377或SEQIDNO：13的221-327位置的氨基酸殘基的至少N-端部分以及p是0或1的整數，其中Z2和Z3氨基酸殘基總數是在80和140之間，兩端數值包括在內。Z1可以是氨基酸序列，其包括來自于SEQIDNO：11的90-98位置的氨基酸殘基C-端側的5到9個連續氨基酸殘基，或者來自于SEQIDNO：14的90-98位置的氨基酸殘基C-端側的5-9個連續氨基酸殘基。在一些實施方式中，Z1可以是IgG1CH1結構域(SEQIDNO：11)或IgDCH1結構域(SEQIDNO：14)的5、6、7本文檔來自技高網...

【技術保護點】
嵌合多肽，包括雜交Fc多肽；和偶聯至所述雜交Fc多肽的G?CSF，其變體或片段，其中所述雜交Fc多肽由下式表示：N'?(Z1)p?Y?Z2?Z3?Z4?C'其中N'是所述雜交Fc多肽的N?端并且C'是所述雜交Fc多肽的C?端；Z1是由SEQ?ID?NO:14的90至98位置的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Y是由SEQ?ID?NO:14的133至162位置的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Z2是由SEQ?ID?NO:14的163至170位置的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Z3是由SEQ?ID?NO:13的121至220位置的連續氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Z4是由SEQ?ID?NO:13的氨基酸殘基221至327的連續氨基酸序列組成的氨基酸序列；以及p是0或1的整數，其中所述G?CSF、其變體或片段被融合到所述雜交Fc多肽的N?端或C?端，并且其中融合到所述雜交Fc多肽的所述G?CSF、其變體或片段顯示與沒有融合到雜交Fc多肽的所述G?CSF、其變體或片段的循環半衰期相比增加的循環半衰期，并且具有G?CSF活性。

【技術特征摘要】
2007.05.30 US 60/940,7531.嵌合多肽，其由下列組成：雜交Fc多肽；和偶聯至所述雜交Fc多肽的G-CSF，其中所述雜交Fc多肽由下式表示：N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'其中N'是所述雜交Fc多肽的N-端并且C'是所述雜交Fc多肽的C-端；Z1是由SEQIDNO:14的90至98位置的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Y是由SEQIDNO:14的133至162位置的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Z2是由SEQIDNO:14的163至170位置的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Z3是由SEQIDNO:13的121至220位置的連續氨基酸殘基組成的氨基酸序列；Z4是由SEQIDNO:13的氨基酸殘基221至327的連續氨基酸序列組成的氨基酸序列；以及p是0或1的整數，其中所述G-CSF被融合到所述雜交Fc多肽的N-端或C-端，并且其中融合到所述雜交Fc多肽的所述G-CSF顯示與沒有融合到雜交Fc多肽的所述G-CSF的循環半衰期相比增加的循環半衰期，并且具有G-CSF活性。2.權利要求1所述的嵌合多肽，其中所述雜交Fc多肽由核苷酸序列SEQIDNO:5編碼。3.權利要求...

【專利技術屬性】
技術研發人員：成永喆，梁世煥，
申請(專利權)人：浦項工科大學校產學協力團，格納西尼有限公司，
類型：發明
國別省市：韓國;KR