一種雙光子激發熒光檢測三聚氰胺的方法技術

本發明專利技術公開了一種雙光子激發熒光檢測三聚氰胺的方法。本方法利用雙光子激發熒光方法檢測三聚氰胺，而雙光子激發熒光具有深穿透性，因此本方法能夠在復雜環境中進行三聚氰胺的檢測，應用范圍廣。本發明專利技術在復雜環境中三聚氰胺的檢測方面具有巨大的應用潛力，可為三聚氰胺的監管提供新的檢測手段。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于化學分析領域，具體涉及。
技術介紹
三聚氰胺（英文名：Melamine)，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，簡稱三胺，又 叫蜜胺，三聚氰酰胺，氰脲三酰胺，其含氮量為66%，是牛奶含氮量的4倍。 三聚氰胺是一種國家嚴禁用于寵物和人食品及動物飼料的化學物質，人或動物食 用后誘發腎衰甚至死亡。2007年3月，美國發生多起因食用寵物食品而導致寵物中毒死亡 事件。2008年9月，中國發生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導致嬰幼兒產生腎結石病癥的嚴重事 件。兩起事件的原因都是在食品或飼料中非法添加大劑量三聚氰胺。隨著三聚氰胺引發的 一系列食品安全事件的曝光，關于三聚氰胺的分析檢測方法引起有關部門和科研工作者的 高度重視。國家科技部于2008年9月28日向社會公開征集液態奶中三聚氰胺快速檢測技 術和廣品。 2008年10月7日，國家標準委員會發布原料乳和乳制品中三聚氰胺的檢測方法， 規定了液相色譜、氣相色譜質譜法、液相色譜質譜法三種標準測定方法。 超高效液相色譜法：在奶粉樣品中加入三氯乙酸和醋酸鉛溶液使蛋白質部分沉 淀，過混合型陽離子交換柱（MCX)純化，離心后用0.45μπι濾膜過濾，用超高效液相色 譜-質譜-質譜聯用儀（UPLC2MS2MS)分析測定。與用相同溶劑配置的一組標準溶液測定的 標準曲線對照讀出三聚氰胺含量。優缺點：本法測定低含量三聚氰胺成份靈敏、結果準確， 但儀器昂貴。 氣相色譜-質譜聯用法：樣品經三氯乙酸使蛋白沉淀離心后過MCX固相萃取柱凈 化，氮氣吹干、硅烷化衍生，再由氣相色譜-質譜聯用儀檢測。優缺點：試劑用量少，精確 度高，安全可行，但必須經過復雜的衍生步驟，操作繁瑣，工作效率低。 離子色譜-紫外檢測測定法：用乙腈為4:5(V/V)的比例沉降蛋白，用IonPac CS17 色譜柱進行分離，配制三聚氰胺不同濃度的系列標準溶液，測其紫外光譜圖，以標準品質量 濃度（X)為橫坐標，峰面積（Y)為縱坐標，同時用最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線回 歸方程為Y = I. 8697X - 0. 0050 (r = 0. 99995)，用樣品的峰面積對照標準曲線回歸方程即 得樣品濃度。優缺點：精確度高，無色譜干擾，重現性良好，但試驗成本較高，柱子易污染，操 作較復雜。 以上方法雖然各有其優點，但是均需要大型精密儀器，復雜的樣品前處理和專業 操作人員。根據我國對乳制品進行批批檢測的規定要求，上述方法不能滿足乳制品行業檢 測需求，開發快速、簡便的檢測方法非常重要。 除此之外，還有酶聯免疫吸附法：取樣品粉碎過20目分級篩并混合均勻，加甲醇 后離心取上清液，用氮氣吹干，加入PBS溶液充分溶解，用三聚氰胺定量檢測試劑盒，混合 三聚氰胺酶反應后在450nm波長下測量OD值。配置一組三聚氰胺標準溶液在酶標儀上測 得的吸光度值繪制成標準曲線，對照標準曲線即可得三聚氰胺含量。優缺點：選擇性好、靈 敏度高、結果判斷客觀準確、實用性強、經濟、安全，但不能夠同時分析多種成分。 比色法：通過金納米粒子與三聚氰胺結合形成復合物而發生團聚，導致金納 米粒子粒徑變大，顏色發生變化，從而反映待測樣品中三聚氰胺的含量。例如公開號為 CN101846631A的中國專利通過金納米粒子的制備、冠醚的衍生化、金納米粒子偶聯冠醚、運 用金納米粒子自組裝和分子識別檢測三聚氰胺；實際樣品檢測等步驟。根據金納米粒子體 系的顏色變化，可檢測奶粉中的三聚氰胺含量。 然而，想要檢測復雜環境中（如生物體內）三聚氰胺的含量，上述的這些方法受體 內復雜環境的影響較大，難以實施。
技術實現思路
專利技術目的：本專利技術要解決的技術問題是提供一種雙光子激發熒光檢測三聚氰胺的 方法，用以解決現有技術在復雜環境中檢測三聚氰胺實施難度較大的問題。 技術方案：本專利技術提供，按以下步驟進 行： 步驟1，將HAuCl^液加入到去離子水中，去離子水的加入量與HAuCl 4溶液體積 比為80:0. 25~120:0. 25,優選100:0. 25,加熱至沸騰，然后，將檸檬酸鈉溶液加入到沸騰 液中，檸檬酸鈉溶液的加入量與HAuCl4溶液體積比為5. 5:1~7. 5:1，優選6:1，反應結束 后停止攪拌，靜置冷卻至室溫，得到含金納米粒子的溶液； 步驟2,將上述得到的金納米粒子溶液加入去離子水中，去離子水的加入量與金納 米粒子溶液體積比為1:1~1. 2,優選1: 1，加入不同濃度的三聚氰胺，混合均勻后，室溫下 放置10~15min，優選lOmin，得到混合溶液； 步驟3,將上述混合溶液加入去離子水，去離子水的加入量與混合溶液體積比為 1:3. 5~4,優選1:3. 8,得到待測試樣品； 步驟4,將激光束聚焦在待測試樣品上，樣品發出的發射光被與激發光源成直角的 光纖收集，光纖連著單色器和計算機系統，在光譜儀之前放置一個短波通過750nm的過濾 器，最大限度降低從激發光產生的散射。 步驟5,將所得雙光子熒光信號對三聚氰胺濃度做曲線，從曲線上讀出檢測限以及 檢測范圍。 上述步驟1中的HAuCl4溶液的濃度為0. lmol/L ;所述檸檬酸鈉溶液的濃度為 0.lg/mL〇 上述步驟1中反應結束的判斷方法為：加入檸檬酸鈉溶液后，溶液5s后變成淺藍 色，Imin后變成酒紅色，繼續反應15min后，反應結束。 在步驟1中，通過調節所加入檸檬酸鈉溶液的體積，可以控制所得到的金納米粒 子的粒徑，研究中發現，金納米粒子的粒徑不同，對三聚氰胺濃度的檢測限不同，對準確度 也有一定影響。金納米粒子15nm時，背景信號小，噪音小，故樣品的雙光子熒光增強倍數較 高，檢測限較好，檢測準確度更高。金納米粒子50nm時，背景信號大，噪音大，故樣品的雙光 子熒光增強倍數較低，檢測限較差，檢測準確度更低。因此，我們確定最合適的金納米粒子 粒徑的范圍是15~50nm。 在步驟1中，通過調節去離子水與HAuCl4溶液的體積比，可以控制所得到的金納 米粒子溶液的濃度10. 4~16. 3nmol/L，研究中發現，金納米粒子的濃度改變，主要會影響 三聚氰胺的檢測限和檢測范圍，理論上，金納米粒子的濃度越大，檢測限越好，檢測范圍越 窄；金納米粒子的濃度越小，檢測限越差，檢測范圍越寬。 實際上，本專利技術所述檢測方法可以根據實際檢測需要改變金納米粒子的濃度，從 而改變三聚氰胺檢測的檢測限及檢測范圍。 上述步驟 4 中所述的激光束是用 Avesta TiF-IOOM femtosecond Ti : sapphire 振 蕩器做雙光子熒光激發光源，其中輸出激光脈沖中心波長在810nm，脈沖持續時間80fs，重 復率84. 5MHz。研究中發現，激光的功率對檢測結果的影響是激光功率太小，雙光子熒光信 號太弱，檢測的誤差較大；激光功率適中，雙光子熒光信號強，檢測的誤差較小；激光功率 太大，金納米粒子部分恪化，雙光子焚光信號弱，檢測的誤差較大。積分時間對檢測結果的 影響同激光的功率，過短，雙光子信號弱，誤差大；適中，雙光子焚光信號強，誤差小；過長， 金納米粒子部分熔化，雙光子熒光信號弱，檢測的誤差較大。因此，我們確定較合適的激光 功率為功率為20~60mW，優選40mW ;較合適的積分時間為2~10s，優選5s。 有益效果：本專利技術利用雙光子激本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雙光子激發熒光檢測三聚氰胺的方法，其特征在于按以下步驟進行：步驟1，將HAuCl4溶液加入到去離子水中，去離子水的加入量與HAuCl4溶液體積比為80:0.25～120:0.25，加熱至沸騰，然后，將檸檬酸鈉溶液加入到沸騰液中，檸檬酸鈉溶液的加入量與HAuCl4溶液體積比為5.5:1～7.5:1，反應結束后停止攪拌，靜置冷卻至室溫，得到含金納米粒子的溶液；步驟2，將上述得到的金納米粒子溶液加入去離子水中，去離子水的加入量與金納米粒子溶液體積比為1:1～1.2，加入不同濃度的三聚氰胺，混合均勻后，室溫下放置10～15min，得到混合溶液；步驟3，將上述混合溶液加入去離子水，去離子水的加入量與混合溶液體積比為1:3.5～4，得到待測試樣品；步驟4，將激光束聚焦在待測試樣品上，樣品發出的發射光被與激發光源成直角的光纖收集，光纖連著單色器和計算機系統，在光譜儀之前放置一個短波通過750nm的過濾器，最大限度降低從激發光產生的散射。步驟5，將所得雙光子熒光信號對三聚氰胺濃度做曲線，從曲線上讀出檢測限以及檢測范圍。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：姜翠鳳，龐紹平，羅駒華，劉學然，孫瑜，
申請(專利權)人：鹽城工學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32