人肝細(xì)胞長(zhǎng)期維持和增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開一種人肝細(xì)胞長(zhǎng)期維持和增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。首次揭示一種優(yōu)化的肝細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基可長(zhǎng)期增殖傳代和維持培養(yǎng)人肝細(xì)胞，并保持其形態(tài)功能。應(yīng)用本發(fā)明專利技術(shù)的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，成本低廉且安全穩(wěn)定。所培養(yǎng)和增殖傳代獲得的人肝細(xì)胞，可用于臨床細(xì)胞移植治療肝病，還可用作肝病相關(guān)機(jī)理研究，生物人工肝構(gòu)建，藥物肝毒性和藥效、藥靶檢測(cè)等相關(guān)基礎(chǔ)研究的肝細(xì)胞來(lái)源或細(xì)胞模型，應(yīng)用前景廣闊。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本專利技術(shù)涉及人肝細(xì)胞體外長(zhǎng)期維持和 增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有上百萬(wàn)的人死于肝病。中國(guó)是一個(gè)肝病大國(guó)， 僅己型和丙型肝炎病毒帶原者就有1. 4億，約占全球的28%;有29. 7萬(wàn)肝癌患者，占全球的 一半W上（55%)。因此在肝病研究、新藥肝毒檢測(cè)、生物人工肝及肝細(xì)胞移植等方面，需要 大量的合格人肝細(xì)胞。但肝源缺乏是全球問(wèn)題，而現(xiàn)有人肝細(xì)胞培養(yǎng)方法都存在常規(guī)培養(yǎng) 維持其形態(tài)功能時(shí)間短，非常規(guī)培養(yǎng)操作繁雜、要求條件高、干擾因素多、培養(yǎng)時(shí)間不夠長(zhǎng)， 并且都不能增殖傳代等缺陷。因此亟待研究新的人肝細(xì)胞培養(yǎng)增殖傳代方法。 人肝細(xì)胞在醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域有極為廣泛的應(yīng)用。長(zhǎng)期W來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝細(xì)胞的 培養(yǎng)方法作了大量研究，但在常規(guī)培養(yǎng)條件下，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)肝細(xì)胞并保持其形態(tài)功能的方 法，目前尚未見任何報(bào)道。尤其是讓肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下增殖傳代，更是難W突破。目 前分離的人肝細(xì)胞在體外常規(guī)培養(yǎng)最長(zhǎng)可達(dá)14天，其它方法如共生培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、H明 治培養(yǎng)、H維培養(yǎng)等最長(zhǎng)可W培養(yǎng)肝細(xì)胞到3個(gè)月。但由于干擾因素多（如共生培養(yǎng)）、操 作繁雜（H明治培養(yǎng)）、或者不能直接觀察細(xì)胞的形態(tài)改變（懸浮培養(yǎng)和H維培養(yǎng)）等送樣 郝樣的缺陷而無(wú)法滿足肝病研究的需要，因此僅部分用于檢測(cè)新藥物的肝毒性。然而，即使 用于檢測(cè)新藥物的肝毒，由于存在上述各種缺陷，所得結(jié)果也僅有相對(duì)的意義和價(jià)值。更大 的問(wèn)題是，上述現(xiàn)有人肝細(xì)胞培養(yǎng)方法，都不能增殖傳代。因此，現(xiàn)有方法及所培養(yǎng)肝細(xì)胞 不僅不能作為肝病研究的合格細(xì)胞模型，更不可能為構(gòu)建生物人工肝及肝細(xì)胞移植提供合 格的肝細(xì)胞來(lái)源。 綜上，本領(lǐng)域還有必要開發(fā)新型的人肝細(xì)胞長(zhǎng)期維持和增殖傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)方法 及專用培養(yǎng)基。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種人肝細(xì)胞長(zhǎng)期維持和增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和 培養(yǎng)方法。 在本專利技術(shù)的第一方面，提供一種用于培養(yǎng)人肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包括： 肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基；W及GSK3 目抑制劑CHIR99021 ;0. 5-10UM;TGF目抑制劑SB431542 ;0. 5-10UM或 / 和TGF目抑制劑A83-01 ;0. 5-10UM。 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中包括： GSK3 目抑制劑CHIR99021 ;l-4yM;[001引TGF目抑制劑SB431542 ;l-8yM或 / 和 [001引TGF目抑制劑A83-01 ;l-8uM。 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還包括選自下組的成分：[001引N-己醜-半脫氨酸（NAC) ;0. 25-25mM;[001引 制瘤素M(OSM) ;l-100ng/ml;或 / 和 白血病抑制因子OJ巧；100-1000u/ml。 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中包括：[001 引N-己醜-半脫氨酸（NAC) ;0.S-I2.SmM; 制瘤素M(OSM) ;5-80ng/ml;或 / 和 白血病抑制因子OJ巧：150-800u/ml。 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還包括選自下組的成分： 人襲凌細(xì)胞生長(zhǎng)因子 5-! 0化巧/!地 人戒纖維細(xì)臘生長(zhǎng)閨子 5-K)0ng/m; 人沉細(xì)嫩生長(zhǎng):因子 5 -U)0ng/mH 地蠢米松 血小板銜化因子 M00ng./ml; H礫甲狀腺原魏驗(yàn) MOOng/mlo 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中： 乂表皮細(xì)蔽生長(zhǎng)閑r 5-5謝m!， 人成巧維綱胞化長(zhǎng)樹于 5~撕鳴/!化[; 人針細(xì)跑生眨詞rS-SOng/mlt 地?fù)崦姿?04-詠為感1; !虹小板.銜生因r 5-50ng/m!； 鱗巧狀腺爆毀酸 20-80t墻mL 在另一優(yōu)選例中，所述的肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了 2. 5% 肥、5%827、1%非必須氨基酸、1%丙麗酸鋼和青鏈霉素混合液（100訝；或者添加入；5%肥 或10%B27U%非必須氨基酸、1 %丙麗酸鋼和1 %青鏈霉素（100訝等成分得到的培養(yǎng)基。 或直接使用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基替代肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基。所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM/F12、 MEM、DMEM、RPMI1640、Neurona化asal或Fischers等，均為市場(chǎng)上可購(gòu)得的商品。 在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種用于培養(yǎng)人肝細(xì)胞的試劑盒，所述的試劑盒中包 括前面任一所述的培養(yǎng)基。 在本專利技術(shù)的另一方面，提供所述的培養(yǎng)基或所述的試劑盒的用途，用于維持和增 殖傳代培養(yǎng)人肝細(xì)胞。 在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種維持和增殖傳代培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，所述方法包 括；應(yīng)用前面任一所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞。較佳地，所述的培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法包括： (1)將培養(yǎng)板打底（較佳地，用基質(zhì)膠、鼠尾膠、明膠、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋 白其中一種打底）1-24小時(shí)，然后將原代肝細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)基（較佳地，為添加10%血清的 肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基）中混懸，鋪板；37C培養(yǎng)1-12小時(shí)； (2)棄用（1)中的培養(yǎng)基，將肝細(xì)胞分別換入權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。 在另一優(yōu)選例中，前面所述的培養(yǎng)基、試劑盒、用途或方法中，所述的人肝細(xì)胞包 括但不限于；人原代肝細(xì)胞及其傳代肝細(xì)胞，從干細(xì)胞分化所得的人肝細(xì)胞或成體細(xì)胞轉(zhuǎn) 化所得的人肝細(xì)胞。 本專利技術(shù)的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。【附圖說(shuō)明】 圖1、人原代肝細(xì)胞在不同條件培養(yǎng)下，第1，14和20天拍攝的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖2、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 1培養(yǎng)14天的體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖3、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 4培養(yǎng)21天的體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖4、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 1培養(yǎng)35天的體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖5、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 2傳代培養(yǎng)第二代，共培養(yǎng)56天的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖6、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 3傳代培養(yǎng)第二代，共培養(yǎng)80天的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖7、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 2傳代培養(yǎng)第H代，共培養(yǎng)110天的細(xì)胞形態(tài)圖。 圖8、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 2傳代培養(yǎng)的肝細(xì)胞形態(tài)圖。 圖9、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-1.1/2與I-2. 1/2培養(yǎng)人原代肝細(xì)胞，在培養(yǎng)至第 20天時(shí)獲得的細(xì)胞形態(tài)圖。其中，"2個(gè)核必因子"是指"CHIR99021+SB431542"或 "CHIR99021+A83-01"。 圖10、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 2培養(yǎng)84天肝特異性標(biāo)志物的免疫染色。 圖11、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 1培養(yǎng)77天肝系相關(guān)基因的表達(dá)。 圖12、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 1培養(yǎng)11周的P450酶誘導(dǎo)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖13、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 1培養(yǎng)11周的肝細(xì)胞糖原染色。【具體實(shí)施方式】 本專利技術(shù)人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，掲示了一種人肝細(xì)胞長(zhǎng)期維持和增殖傳代培養(yǎng) 的培養(yǎng)基W及培養(yǎng)方法。所述方法克服了現(xiàn)有肝細(xì)胞培養(yǎng)方法的缺陷，可在常規(guī)條件下長(zhǎng) 期維持培養(yǎng)人肝細(xì)胞并使其增殖傳代，且保持與新分離的人原代肝細(xì)胞基本一致的形態(tài)功 能。所述方法培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，成本低廉且安全穩(wěn)定。[004引如本文所用，術(shù)語(yǔ)"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構(gòu)成（制成）"、 "基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"。 培養(yǎng)基 本專利技術(shù)人提供了用于進(jìn)行人肝細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基包括；GSK3目本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于培養(yǎng)人肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的培養(yǎng)基包括：肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基；以及GSK3β抑制劑CHIR99021：0.5?10μM；TGFβ抑制劑SB431542：0.5?10μM或/和TGFβ抑制劑A83?01：0.5?10μM。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張培霖，王紅陽(yáng)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31