微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及微生物能力驗(yàn)證技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，包括：(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌；(B)、菌株的分離；(C)、菌懸液的制備；(D)、冷凍干燥和包裝。最后制備的樣品包括：簡單級陰性樣品，簡單級陽性樣品；中級陰性樣品，中級陽性樣品；困難級陰性樣品，困難級陽性樣品。同一等級的樣品配對使用。本發(fā)明專利技術(shù)方法制備的樣品穩(wěn)定性好，菌種存活率高，且具有合理的不同難度等級標(biāo)準(zhǔn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法
本專利技術(shù)涉及微生物能力驗(yàn)證
，尤其涉及微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法。
技術(shù)介紹
能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量控制的有效措施之一，也是計(jì)量從證和實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的必備條件。實(shí)施微生物能力驗(yàn)證能夠有效評估參與實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)微生物檢驗(yàn)的技術(shù)能力。沙門氏菌作為近年我國食品中毒和食源性疾病常見的病原菌，是能力驗(yàn)證項(xiàng)目常選用的目標(biāo)菌。但是目前，微生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域尚無高可信度、高通量的微生物能力驗(yàn)證制備技術(shù)，不確定因素較多，使得實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證的可信度大打折扣。曹文博等在《食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)》的2015年第6卷第1期公開了一種沙門氏菌能力驗(yàn)證樣品的制備方法：采用真空冷凍干燥的方式制備樣品，該方法在一定程度上提高了樣品的穩(wěn)定性和均勻性，但是仍然不夠理想，且缺乏難度等級對比標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)有的微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品，樣品的菌種穩(wěn)定性較差，菌種的存活率也較低，且不同種類樣品的驗(yàn)證難度不一，缺乏對比標(biāo)準(zhǔn)，因而使得微生物能力驗(yàn)證的意義也大打折扣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法，該方法制備的樣品穩(wěn)定性好，菌種存活率高，具有合理的不同難度等級標(biāo)準(zhǔn)。本專利技術(shù)的具體技術(shù)方案為：微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，包括如下步驟：(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌：將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌和各干擾菌的標(biāo)準(zhǔn)菌分別加入到營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使所述各標(biāo)準(zhǔn)菌復(fù)蘇、生長和增菌，培養(yǎng)期間并對各菌株進(jìn)行菌種鑒定。(B)、菌株的分離：當(dāng)上述培養(yǎng)的沙門氏菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期時(shí)對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到沙門氏菌菌泥；當(dāng)每一種干擾菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到各干擾菌菌泥。(C)、菌懸液的制備：簡單級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陰性樣品菌懸液。簡單級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥和1份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陽性樣品菌懸液。中級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陰性樣品菌懸液。中級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陽性樣品菌懸液。困難級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥、1份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陰性樣品菌懸液。困難級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥、1份大腸桿菌菌泥、1份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陽性樣品菌懸液。上述份數(shù)均為重量份數(shù)；(D)、冷凍干燥和包裝：分別稱取上述制備的每種菌懸液1mL，并分別添加到各自的安瓶中，將所述安瓶平開蓋放入冷凍干燥機(jī)中，在-22℃至-18℃溫度下預(yù)先凍結(jié)7-9h，接著轉(zhuǎn)移到溫度為-50℃至-40℃的冷凍干燥機(jī)中，抽真空并使真空度達(dá)到100μmHg以上，然后將安瓶均勻放置于冷凍室內(nèi)的隔板上，升華干燥45-55h；待安瓶內(nèi)物質(zhì)呈乳白色疏松海綿狀時(shí)，對安瓶繼續(xù)進(jìn)行解析干燥1.5-2.5h；結(jié)束后對安瓶進(jìn)行封口、壓蓋、貼簽，制得微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品，將所述樣品貯存于4℃的環(huán)境中。本專利技術(shù)選用沙門氏菌為目標(biāo)菌，選用粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，并且根據(jù)干擾菌與沙門氏菌檢測時(shí)的相似程度，制備成三個(gè)難度等級樣品組，每個(gè)樣品組包括陽性樣品和陰性樣品。按本專利技術(shù)方法制備的樣品，通過控制制備過程中的各項(xiàng)參數(shù)，使得樣品中菌種的穩(wěn)定性和存活率較高。作為優(yōu)選，所述步驟(A)中各菌株的培養(yǎng)基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培養(yǎng)基中的含量為2-4g/mL。在培養(yǎng)基中添加海藻糖的目的是，菌類在將海藻糖作為碳源進(jìn)行吸收后，海藻糖能夠進(jìn)行菌類的細(xì)胞膜內(nèi)部，當(dāng)進(jìn)行后續(xù)的冷凍干燥過程時(shí)，海藻糖的存在能夠提高菌類的抗凍能力，使得細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞液不易形成冰晶，避免了由于細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞液變成冰晶，升高了細(xì)胞的滲透壓而導(dǎo)致菌類死亡的情況。作為優(yōu)選，在所述步驟(B)中對培養(yǎng)有菌株的各個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行分離前，將所述培養(yǎng)基放置于45-50℃的環(huán)境中1-2h。在進(jìn)行分離前對培養(yǎng)基進(jìn)行上述步驟，有利于菌株對培養(yǎng)基中海藻糖的吸收，有利于海藻糖進(jìn)入菌株細(xì)胞內(nèi)部。作為優(yōu)選，在所述步驟(C)配制各菌懸液時(shí)，所述脫脂牛乳水溶液中還添加有殼聚糖和聚乙烯醇中的一種或多種。殼聚糖或聚乙烯醇的存在，在對菌懸液進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，作為對冷凍保護(hù)劑脫脂牛乳的補(bǔ)充，殼聚糖或聚乙烯醇在冷凍干燥過程中成為凝膠，具有眾多的三維孔道結(jié)構(gòu)，能夠?qū)赀M(jìn)行一定程度的包埋和吸附，形成了一個(gè)緩沖保護(hù)層，起到了一個(gè)隔離作用，在一定程度上削弱了極低溫度對菌株的影響。此外殼聚糖和聚乙烯醇可被菌類自然分解，對菌類無害。作為優(yōu)選，所述殼聚糖或聚乙烯醇在所述脫脂牛乳水溶液中的濃度均為0.2-0.5wt％。作為優(yōu)選，所述聚乙烯醇的相對分子量為16000-20000。在此分子量范圍的聚乙烯醇黏度較低，適合作為保護(hù)劑。作為優(yōu)選，在所述步驟(D)中對所述安瓶進(jìn)行封口和壓蓋時(shí)在冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)操作，且封口后安瓶內(nèi)為真空狀態(tài)。作為優(yōu)選，在所述步驟(A)中對各標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌株，并將其接種到10mL的培養(yǎng)基中。作為優(yōu)選，在所述步驟(B)中配制各菌懸液時(shí)，所述脫脂牛乳水溶液的濃度為10wt％，菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為5×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為5×104cfu/mL。作為優(yōu)選，在所述步驟(D)中，安瓶在的預(yù)先凍結(jié)溫度為-20℃，預(yù)先凍結(jié)8h；接著轉(zhuǎn)移到的冷凍干燥機(jī)的溫度為-45℃；對安瓶的升華干燥時(shí)間為50h；對安瓶的解析干燥時(shí)間為2h。與現(xiàn)有技術(shù)對比，本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)方法制備的樣品穩(wěn)定性好，菌種存活率高，且具有合理的不同難度等級標(biāo)準(zhǔn)。附圖說明圖1是保存溫度以及保存時(shí)間對實(shí)施例2中簡單級陽性樣品穩(wěn)定性的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，包括如下步驟：(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌：用接種環(huán)挑取一環(huán)各菌株本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，其特征在于包括如下步驟：(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌：將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌和各干擾菌的標(biāo)準(zhǔn)菌分別加入到營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使所述各標(biāo)準(zhǔn)菌復(fù)蘇、生長和增菌，培養(yǎng)期間并對各菌株進(jìn)行菌種鑒定；(B)、菌株的分離：當(dāng)上述培養(yǎng)的沙門氏菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期時(shí)對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到沙門氏菌菌泥；當(dāng)每一種干擾菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到各干擾菌菌泥；(C)、菌懸液的制備：簡單級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8?12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液的濃度為(3?7)×104?cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陰性樣品菌懸液；簡單級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥和1份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8?12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3?7)×102?cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3?7)×104?cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陽性樣品菌懸液；中級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8?12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3?7)×102?cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3?7)×104?cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陰性樣品菌懸液；中級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8?12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3?7)×102?cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3?7)×104?cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陽性樣品菌懸液；困難級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥、1份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8?12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3?7)×102?cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3?7)×104?cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陰性樣品菌懸液；困難級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥、1份大腸桿菌菌泥、1份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8?12wt%的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3?7)×102?cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3?7)×104?cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陽性樣品菌懸液；上述份數(shù)均為重量份數(shù)；(D)、冷凍干燥和包裝：分別稱取上述制備的每種菌懸液1mL，并分別添加到各自的安瓶中，將所述安瓶平開蓋放入冷凍干燥機(jī)中，在?22℃至?18℃溫度下預(yù)先凍結(jié)7?9h，接著轉(zhuǎn)移到溫度為?50℃至?40℃的冷凍干燥機(jī)中，抽真空并使真空度達(dá)到100Hg以上，然后將安瓶均勻放置于冷凍室內(nèi)的隔板上，升華干燥45?55h；待安瓶內(nèi)物質(zhì)呈乳白色疏松海綿狀時(shí)，對安瓶繼續(xù)進(jìn)行解析干燥1.5?2.5h；結(jié)束后對安瓶進(jìn)行封口、壓蓋、貼簽，制得微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品，將所述樣品貯存于4℃的環(huán)境中。...

【技術(shù)特征摘要】
1.微生物能力驗(yàn)證沙門氏菌樣品的制備方法，以沙門氏菌為目標(biāo)菌，以粘質(zhì)沙雷氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌為干擾菌，其特征在于包括如下步驟：(A)、菌株的復(fù)蘇、增菌：將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌和各干擾菌的標(biāo)準(zhǔn)菌分別加入到營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使所述各標(biāo)準(zhǔn)菌復(fù)蘇、生長和增菌，培養(yǎng)期間并對各菌株進(jìn)行菌種鑒定；其中各菌株的培養(yǎng)基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培養(yǎng)基中的含量為2-4g/mL；(B)、菌株的分離：當(dāng)上述培養(yǎng)的沙門氏菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期時(shí)對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到沙門氏菌菌泥；當(dāng)每一種干擾菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，對其培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，得到各干擾菌菌泥，其中對培養(yǎng)有菌株的各個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行分離前，將所述培養(yǎng)基放置于45-50℃的環(huán)境中1-2h；(C)、菌懸液的制備：簡單級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陰性樣品菌懸液；簡單級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥和1份大腸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到簡單級陽性樣品菌懸液；中級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陰性樣品菌懸液；中級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌泥、1份大腸桿菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，控制菌懸液中目標(biāo)菌的濃度為(3-7)×102cfu/mL，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到中級陽性樣品菌懸液；困難級陰性樣品菌懸液的制備：將1份大腸桿菌菌泥、1份粘質(zhì)沙雷氏菌菌泥和1份弗氏檸檬酸桿菌菌泥添加到濃度為8-12wt％的脫脂牛乳水溶液中，各干擾菌的濃度為(3-7)×104cfu/mL，攪拌均勻后得到困難級陰性樣品菌懸液；困難級陽性樣品菌懸液的制備：將1份沙門氏菌菌...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡興娟，沈飚，邵宏宏，周秀錦，徐君輝，楊賽軍，
申請(專利權(quán))人：舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33