檢測(cè)人EGFR基因突變的引物和探針體系及試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種檢測(cè)人EGFR基因29種突變的引物和探針體系，包括如SEQ?ID?No：1～26所示的核苷酸序列；還涉及一種檢測(cè)人EGFR基因29種突變的方法，包括合成引物和探針、在引物3’?末端起第2或第3位置引入脫氧次黃嘌呤核苷、熒光PCR反應(yīng)以收集熒光信號(hào)FAM和HEX、結(jié)果判定等步驟；以及包括所述引物和/或探針中至少一種的試劑盒。該引物和探針體系具有很高的靈敏度，可以滿足低突變豐度樣本的檢測(cè)，即在野生基因組DNA的背景下，可以完成較低突變基因含量的檢測(cè)，以高度的敏感性和特異性準(zhǔn)確區(qū)分樣本類(lèi)型，發(fā)揮技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
檢測(cè)人EGFR基因突變的引物和探針體系及試劑盒
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物工程
，具體涉及一種檢測(cè)人EGFR基因突變的引物和探針體系及試劑盒。
技術(shù)介紹
大量研究表明，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）人群中40%左右的患者攜帶表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因的體細(xì)胞突變，這些突變與絡(luò)氨酸激酶抑制劑（TKIs）療效有明確的相關(guān)性，如易瑞沙（Iressa）和特羅凱（Tarceva）等藥物。其中，不含T790M突變，但攜帶EGFR基因其它位點(diǎn)突變的NSCLC患者在接受易瑞沙和特羅凱治療時(shí)療效顯著，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)EGFR外顯子20上的T790M位點(diǎn)為耐藥位點(diǎn)，會(huì)抑制易瑞沙和特羅凱等藥物的療效。EGFR基因位于7號(hào)染色體上，包含28個(gè)外顯子，其酪氨酸激酶功能區(qū)由18～24外顯子編碼，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的EGFR基因突變主要發(fā)生在18～21外顯子，其中以19外顯子上的缺失突變和21外顯子上的點(diǎn)突變居多；主要突變類(lèi)型包括18外顯子上的點(diǎn)突變（G719X）約占5%，19外顯子上的缺失突變（主要位于747～750位氨基酸）約占45%，20外顯子上的插入突變約占1%，20外顯子上的耐藥點(diǎn)突變（T790M）約占5%，21外顯子上的點(diǎn)突變（L858R和L861Q）約占40～45%。目前的基因突變檢測(cè)方法如突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)、TaqMan技術(shù)等，雖然廣泛應(yīng)用在臨床檢測(cè)工作中，但是其聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)引物存在以下缺點(diǎn)：(1)特異性不好，診斷基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性；(2)選擇性不好，在高濃度野生型背景下，檢測(cè)低拷貝能力較差；(3)敏感性和分辨率較差，受到引物設(shè)計(jì)的限制，導(dǎo)致檢測(cè)的敏感性差，分辨率不高。隨著基因時(shí)代的開(kāi)啟，分子診斷技術(shù)在臨床輔助診斷中扮演越來(lái)越重要的角色，如SNP、基因突變等檢測(cè)逐步應(yīng)用于臨床的輔助診斷和個(gè)性化用藥。核酸檢測(cè)技術(shù)（nucleicacidamplificationtesting，NAT）包含兩種擴(kuò)增方式：對(duì)靶核酸直接擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增。對(duì)靶序列的擴(kuò)增又可以分為等溫?cái)U(kuò)增（isothermalamplification，IA）和聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包含：轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法TMA(transcriptionmediatedamplification)、NASBA（Nucleicacidsequence-basedamplification）、SDA（stranddisplacementamplification）等。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（transcriptionmediatedamplification，TMA）由Dr.LarryMimms專(zhuān)利技術(shù)，并且其公司Gen-Probe2004年因此獲得美國(guó)國(guó)家技術(shù)獎(jiǎng)（NationalMedalofTechnology）。TMA反應(yīng)體系需要兩種酶的共同作用：鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloneymurineleukemiavirus，MMLV）和T7RNA多聚酶；在42°C恒溫條件下來(lái)擴(kuò)增DNA或RNA的反應(yīng)系統(tǒng)。擴(kuò)增原理為：在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，目標(biāo)序列以引物為引導(dǎo)來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在雜合鏈上的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降解以后，合成雙鏈的DNA；且在T7RNA多聚酶的作用下，轉(zhuǎn)錄出數(shù)以萬(wàn)計(jì)的目標(biāo)RNA序列，所轉(zhuǎn)錄出的RNA可以作為模板來(lái)進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)自催化過(guò)程。依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）的擴(kuò)增原理與TMA擴(kuò)增原理相似，但在提取核酸和產(chǎn)物擴(kuò)增檢測(cè)的方法上存在不同，這兩種擴(kuò)增方法的靈敏度較高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高，均無(wú)需專(zhuān)門(mén)的擴(kuò)增儀器。TMA和NASBA，由于其高效的擴(kuò)增能力，廣泛用于血液中乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）和艾滋病毒（hepatitisIvirus，HIV）的篩查，但是其擴(kuò)增基因突變和SNP的能力尚未得到驗(yàn)證。基于等溫?cái)U(kuò)增開(kāi)發(fā)的SNP或基因突變的檢測(cè)雖然較少，如Invader和SMARTamplification，但是Invader技術(shù)已經(jīng)推廣于臨床SNP和基因突變的檢測(cè)。Invader技術(shù)可以認(rèn)為是一種信號(hào)放大技術(shù)，該技術(shù)不以模板擴(kuò)增為核心，主要通過(guò)信號(hào)系統(tǒng)本身的不斷放大從而達(dá)到基因檢測(cè)的目的。Invader技術(shù)原理：Invader技術(shù)設(shè)計(jì)了一套非常特別的invader和空間結(jié)構(gòu)識(shí)別內(nèi)切酶。當(dāng)檢測(cè)有突變存在，酶切下primaryprobe1的5’-端序列，作為下一個(gè)反應(yīng)的invader，信號(hào)持續(xù)產(chǎn)生。SMRAT為模板擴(kuò)增的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，檢測(cè)基因突變主要依賴(lài)于Mut蛋白，當(dāng)無(wú)突變，檢測(cè)突變的引物與模板結(jié)合時(shí)3’-端有錯(cuò)配，Mut蛋白結(jié)合抑制Bst聚合酶的延伸。上述的兩種等溫突變檢測(cè)技術(shù)，需要一個(gè)95°C變性后降溫然后加酶的過(guò)程，不易于臨床接受和開(kāi)展。此外，Junctionprobes（JP）和ThreeWayJunction（3WJ）突變檢測(cè)信號(hào)系統(tǒng)，這兩項(xiàng)技術(shù)不能獨(dú)自檢測(cè)基因突變，需要PCR等過(guò)程擴(kuò)增出數(shù)以萬(wàn)計(jì)的單鏈DNA，再應(yīng)用該技術(shù)雜交，臨床應(yīng)用價(jià)值很低，但該技術(shù)引出類(lèi)似“短片段引物雜交”的雛形。JP和3WJ技術(shù)原理，簡(jiǎn)述如下：step1，在特定的反應(yīng)條件和靶序列存在下，探針PB錨定靶序列；step2，探針PA識(shí)別SNP并于PB和靶序列形成穩(wěn)定的Y型結(jié)構(gòu)；step3，限制性?xún)?nèi)切酶-CviQ(1)識(shí)別酶切位點(diǎn)并切割下淬滅基團(tuán)產(chǎn)生熒光；step4，位于PB上的酶切位點(diǎn)堿基之間被硫代，所以無(wú)法酶切而保留完整，PA切斷后，殘余片段無(wú)法與PB和靶序列形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)而脫落；剩余PB和靶序列在進(jìn)入下一步循環(huán)放大。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）專(zhuān)利技術(shù)之后，基于PCR開(kāi)發(fā)的基因突變技術(shù)不斷衍生出新的檢測(cè)手段和技術(shù)，如：PCR-RFLP，allele-sepecificPCR，TaqManprobe，ARMS，PNA-LNAclamp熒光PCR、CycleaveprobePCR，NanofluidicDigitalPCRArrays，MassArray和DNA芯片等等。PCR-RFLP是在早期實(shí)驗(yàn)中開(kāi)發(fā)的檢測(cè)SNP分型技術(shù)，主要優(yōu)點(diǎn)在于可以巧妙地選擇出限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)切出可用于分辨突變位點(diǎn)的短片段長(zhǎng)度多態(tài)，不過(guò)PCR-RFLP需要電泳分離酶消化后的產(chǎn)物，會(huì)嚴(yán)重制約反應(yīng)的通量和實(shí)驗(yàn)操作的自動(dòng)化。ARMS技術(shù)與allele-sepecificPCR大致相同，利用DNA聚合酶缺失3’～5’端的外切活性，3’端錯(cuò)配的引物低于正常引物的延伸速度，當(dāng)錯(cuò)配數(shù)目達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，3’端則無(wú)法延伸，如果PCR有條帶，說(shuō)明有相應(yīng)的突變。ARMS技術(shù)敏感性和特異較高，已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床檢測(cè)SNP，但是ARMS技術(shù)引物和探針的設(shè)計(jì)受到突變鄰近堿基的局限，大大的限制該技術(shù)的廣泛使用。TaqMan探針是寡核酸探針，有熒光報(bào)告基團(tuán)連接在探針的3’末端，有熒光淬滅基團(tuán)連接在本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)人EGFR基因29種突變的引物和探針，包括如SEQ?ID?No：1～26所示的核苷酸序列。

【技術(shù)特征摘要】
1.檢測(cè)人EGFR基因突變的引物和探針，由SEQIDNo：1～12、15～26所示的核苷...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳曉琦，蔣晶，張傳雷，李妍妍，鄭玉玲，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：陳曉琦，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：河南;41