一種棉花ATP水解酶ATPase?2及其編碼基因與應用制造技術

提供一種植物蛋白質及其編碼基因與應用，特別是一個來源于棉花的ATP水解酶及其編碼基因，以及其在培育耐鹽性提高的轉基因植物中的應用。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】一種棉花ATP水解酶ATPase-2及其編碼基因與應用
本專利技術涉及植物蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一個來源于棉花的ATP水解酶ATPase-2及其編碼基因，以及其在培育耐鹽性提高的轉基因植物中的應用。
技術介紹
鹽脅迫是世界農業生產最重要的非生物逆境危害之一，鹽漬土壤通常以鈉鹽、鈣鹽或鎂鹽為主，成為影響植物生長、導致糧食和經濟作物減產的主要因素。世界上鹽堿土的面積約有4億公頃，占灌溉農田的1/3。鹽堿地在中國分布廣泛，現有鹽堿地面積約0.4億公頃。隨著我國人口增加，耕地減少，鹽堿地資源的開發利用有著極其重要的現實意義。而植物抗鹽堿、耐干旱能力的提高和適宜在鹽堿地上生長并具有較高經濟和生態價值的植物種或品系的選育，則是利用鹽堿地經濟、有效的措施。對絕大多數農作物來說，大多數植物對鹽堿、干旱的耐受性差，只能生長在氯化鈉含量為0.3％以下的土壤上，土壤中過量的Na+會對植物體的正常的生長代謝產生毒害作用。因此如何在鹽漬環境下提高作物產量就成為全世界農業生產中十分重要的問題。植物的耐鹽性是一個十分復雜的數量性狀，其耐鹽機制涉及從植株到器官、組織、生理生化直至分子的各個水平。各國的科學家也為此做了大量的工作，并取得了很多新進展，特別在利用高等模式植物擬南芥來研究植物的耐鹽分子機理方面，使該領域的研究有了突破性的進展(ZhuJK.2002.Saltanddroughtstresssingaltransductioninplants.Annu.Rev.PlantBiol.53：1247-1273；ZhangZL.2011.ArabidopsisFloralInitiatorSKB1ConfersHighSaltTolerancebyRegulatingTranscriptionandPre-mRNASplicingthroughAlteringHistoneH4R3andSmallNuclearRibonucleoproteinLSM4Methylation.PlantCell，23：396-411)。高等植物細胞可通過多種途徑感受外界環境中物化參數的變化，從而將胞外的信號轉化為胞內信號，通過系列的信號傳導最后將脅迫信號傳遞至細胞核內，激活轉錄因子，而被激活的轉錄因子再作用于功能基因，啟動逆境應答基因的表達從而提高植物的耐逆性。盡管研究者已從不同側面開展了大量研究，但由于其機制十分復雜，植物抗鹽中的許多重要問題仍有待探索。例如，植物抗鹽的關鍵因子仍未找到；植物耐鹽的分子機制并不十分清楚。
技術實現思路
本專利技術人利用SSH(抑制差減雜交)與RACE(cDNA末端快速擴增)相結合的方法克隆了棉花的一個ATP水解酶(本文命名為ATPase-2)的編碼基因，并測定了其DNA序列。并且發現通過轉基因技術將其導入植株后，可明顯改善轉基因植株的耐鹽性，而且這些性狀可穩定遺傳。本專利技術第一方面提供棉花的一個ATP水解酶ATPase-2的編碼基因(本文命名為GhATPase-2)，其序列為SEQIDNO：2。本專利技術第二方面提供一種重組表達載體，其含有本專利技術第一方面所述的基因，其是通過所述基因插入到一種表達載體而獲得的，并且所述基因的核苷酸序列與所述重組表達載體的表達控制序列可操作地連接；優選地，所述表達載體是pCAMBIA2300；優選地，所述重組表達載體為附圖2所示的35S-GhATPase-2-2300載體。本專利技術第三方面提供一種重組細胞，其含有本專利技術第一方面所述的基因或者本專利技術第二方面所述的重組表達載體；優選地，所述重組細胞為重組農桿菌細胞。本專利技術第四方面提供一種改善植物耐鹽性的方法，包括：將本專利技術第一方面所述基因或者本專利技術第二方面所述的重組表達載體導入植物或植物組織并使所述基因表達；優選地，所述植物是擬南芥。本專利技術第五方面提供一種制備轉基因植物的方法，包括：在有效產生植物的條件下培養含有本專利技術第一方面所述基因或者本專利技術第二方面所述的重組表達載體的植物或植物組織；優選地，所述植物是擬南芥。本專利技術第六方面提供本專利技術第一方面所述的基因、本專利技術第二方面所述的重組表達載體或者本專利技術第三方面所述的重組細胞用于改善植物耐鹽性以及用于植物育種的用途；優選地，所述植物是擬南芥。本專利技術第七方面提供由本專利技術第一方面所述的基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附圖說明圖1是GhATPsae-2基因的植物表達載體(35S-GhATPase-2-2300)構建流程(圖1a-1b)。圖2是GhATPase-2基因的植物表達載體(35S-GhATPase-2-2300)的質粒圖。圖3是轉GhATPase-2基因的的T1代擬南芥植株的耐鹽實驗結果，T1i5表現出明顯的耐鹽性，T1i13、T1i16的結果與其類似，在此未示出。圖4為利用反轉錄PCR對T1代轉基因擬南芥植株和非轉基因對照植株中GhATPase-2基因的轉錄水平進行分子水平檢測的結果。M為DNALadderMarker(DL2000)，1-8為耐鹽T1代轉基因擬南芥植株(分別屬于T1i5、T1i13、T1i16三個株系)，9為質粒PCR陽性對照(35S-GhATPase-2-2300質粒)，10-13為非轉基因對照擬南芥植株，。具體實施方式提供以下實施例，以方便本領域技術人員更好地理解本專利技術。所述實施例僅出于示例性目的，并非意在限制本專利技術的范圍。下面實施例中提到的未注明來源的限制性內切酶均購自NewEnglandBiolabs公司。實施例1.鹽脅迫下棉花SSH文庫構建：具體方法為：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒說明書所示的方法通過抑制差減雜交方法構建SSH文庫(抑制差減文庫)。在實驗過程中以鹽處理的棉花根組織中提取的mRNA作為樣本(Tester)，以未處理的棉花根組織中提取的mRNA作為對照(Driver)。具體步驟如下：(1)供試材料：非洲棉(國家棉花中期庫，獲取單位中國棉花研究所，統一編號：ZM-06838)播種到滅過菌的蛭石上，在25℃、光暗周期16h/8h條件下培養，每周澆1/2MS培養基(9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。當苗株長高達25-30cm時用于實驗。(2)材料處理：將供試幼苗分為2組，每組4株。第一組為對照組，在25℃、光照下培養，放置到1/2MS液體培養基中。第二組為處理組，25℃、光照下培養，放置到添加有終濃度為200mMNaCl的1/2MS液體培養基中，處理6小時，處理完畢后及時剪取兩組幼苗的根，用液氮迅速冷凍后，于-70℃冰箱中保存。(3)總RNA提取：分別取對照組和鹽處理組的棉花根0.5g，用植物RNA提取試劑盒(購自Invitrogen)提取總RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度計U-2001測定所得總RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值為1.8-2.0，表明總RNA純度較高本文檔來自技高網...

【技術保護點】
PCT國內申請，權利要求書已公開。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.棉花的一個ATP水解酶，其序列為SEQIDNO：1。2.編碼權利要求1的ATP水解酶的基因，其序列為SEQIDNO：2。3.一種重組表達載體，其是通過將權利要求2所述的基因插入到一種表達載體而獲得的，并且所述基因的核苷酸序列與所述表達載體的表達控制序列可操作地連接，所述表達載體是pCAMBIA2300。4.權利要求3所述的重組表達載體，其為附圖2所示的35S-ThATPase-2-2300載體。5.一種重組細胞，其含有權利要求2所述的基因或者權利要求3或4所述的重組表達載體...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何云蔚，崔洪志，王建勝，田大翠，梁麗，
申請(專利權)人：創世紀種業有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44