本發明專利技術屬于基因工程技術領域，具體涉及一種能夠提高普魯蘭酶比酶活和熱穩定性的普魯蘭酶產酶基因、含有該基因的載體、及該載體在普魯蘭酶制備中的應用。該基因與保藏編號CGMCC?NO.10357的變棲克雷伯氏菌HN7的野生型普魯蘭酶基因相比，其去除信號肽后N端缺少31個氨基酸對應的堿基序列，具體序列如序列表所示。本發明專利技術同時利用基因工程手段提供了一種含有該基因的載體，將該載體用于普魯蘭酶制備后，與原始出發菌株變棲克雷伯氏菌HN7（Klebsiella?variicola??HN7）相比，所制得的普魯蘭酶的比酶活、熱穩定性以及對普魯蘭糖的底物親和能力和催化效率都有了極大提高，顯現出較好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程
，具體涉及一種能夠提高普魯蘭酶比酶活和熱穩定性的普魯蘭酶產酶基因、含有該基因的載體、及該載體在普魯蘭酶制備中的應用。
技術介紹
淀粉是地球上比較豐富的生物質資源，它的主要組成單位是葡萄糖。淀粉除了直接作為食品原料外，還可通過化學或生物的方法生成其他有價值的物質，包括:氨基酸、葡萄糖漿、有機酸、酒精等。淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的混合物，其中直鏈淀粉是由葡萄糖單體通過α -1, 4糖苷鍵形成的，支鏈淀粉的主鏈是由直鏈淀粉組成，其分支處則由α_1，6糖苷鍵形成。工業應用淀粉中支鏈淀粉含量高達70%?95%，其中α-1，6鍵的含量是4%?5%，然而大多數的淀粉酶對α -1, 6糖苷鍵均不起作用，α -淀粉酶和糖化酶聯合使用時也不能達到對淀粉的完全分解，因此α -1, 6糖苷鍵的水解效率直接影響到工業淀粉的利用率。普魯蘭酶是一種脫支酶，能催化普魯蘭糖中α_1，6糖苷鍵的水解。普魯蘭酶可以專一性切下支鏈淀粉的整個支鏈，從而形成直鏈淀粉，因此普魯蘭酶在淀粉工業中具有十分重要的作用。根據普魯蘭酶作用的底物特異性，可將普魯蘭酶分為兩類:1型普魯蘭酶(EC.3.2.1.41)，可以專一性水解寡糖分支處和普魯蘭糖中的α -1, 6糖苷鍵，形成直鏈多糖、麥芽三糖；II型普魯蘭酶(EC.3.2.1.1/41)，又稱淀粉普魯蘭酶，不僅可以水解寡糖分支處、普魯蘭糖中的α-1，6糖苷鍵，同時也可水解淀粉中的α-1，4糖苷鍵。普魯蘭酶在工業上的應用非常廣泛，但是大部分普魯蘭酶的酶活不高，或者不能適應酸性高溫的作用環境，這些因素嚴重的制約了普魯蘭酶的工業應用。我國對普魯蘭酶的研究始于20世紀70年代，起步相對較晚。目前國內市場對普魯蘭酶的需求量很大，主要依賴進口，價格昂貴，因此，國內掀起了一股研究普魯蘭酶的熱潮。由于從自然界篩選普魯蘭酶產生菌具有很大的盲目性，因此越來越多的科研工作者把重點放在了酶的固定化、基因工程、蛋白質工程上面，并取得了一定的成果。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種普魯蘭酶產酶基因，同時本專利技術提供了一種含有該基因的載體，將該載體用于制備普魯蘭酶后，所制備的普魯蘭酶具有較好地熱穩定性和比酶活，顯現出了較好地潛在應用價值。本專利技術的技術方案詳細介紹如下。一種普魯蘭酶產酶基因，該基因含有3156個堿基，與保藏編號CGMCC N0.10357的變棲克雷伯氏菌ΗΝ7 {Klebsiella variicola HN7)的野生型普魯蘭酶基因相比，其信號肽N端缺少31個氨基酸對應的堿基序列，具體序列如序列表SEQ ID N0.1所示。上述普魯蘭酶產酶基因所編碼的普魯蘭酶PU1A-N31，含有1052個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。含有普魯蘭酶產酶基因的載體，通過下述步驟制備而成: (1)提取基因組DNA，提取變棲克雷伯氏菌HN7{Klebsiella variicola HN7)的基因組 DNA ； (2)PCR擴增，具體為，以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，設計如下引物序列，PCR擴增變棲克雷伯氏菌HN7的普魯蘭酶(pulA)基因，擴增產物切膠純化后4°C保存備用； 引物序列設計如下:上游引物 F: 5' -TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT -3'， 下游引物 R: 5' -AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3'； 需要說明的是，上游引物F中的CATATG部分序列為Nde I酶切位點，Nde I識別位點中的ATG為起始翻譯密碼子，下游引物R中的GCGGCCGC部分序列為Abi I酶切位點； (3)構建pMD19-pulA質粒，具體為，將步驟(2)中PCR擴增產物與pMD19_T質粒16°C下連接16h，然后轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，培養12~16h ;提取pMD19_pulA質粒，測序驗證； (4)構建pET21a- pulA表達載體，具體為， 將(4)中測序正確的pMD19-pulA質粒和pET21a在37°(:進行^￡?1、Notl雙酶切16h，膠回收目的條帶； 將上述膠回收產物16°C條件下，T4 DNA連接酶連接16h ； 連接產物轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，提取質粒進行測序驗證； (5)反向PCR，以(4)中測序正確的表達載體pET21a-pulA為模板，設計引物，反向PCR擴增獲得去信號肽N端減少31個氨基酸基因序列的線性序列產物，線性序列產物切膠純化后4 C保存備用； 引物序列設計如下: 上游引物 F-N31:5' -CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3'， 下游引物 R-N31:5' -GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3'； (6)酶連獲得pET21a-pulA-N31表達載體，具體為，將步驟(5)中所獲得線性序列產物用T4 DNA連接酶進行連接構建pET21a-pulA-N31表達載體，然后用Dpn I酶對酶連體系進行酶切處理，以去除體系內不必要物質。所述含有普魯蘭酶產酶基因的載體在普魯蘭酶制備中的應用，具體步驟如下: (I)熱激轉化構建普魯蘭酶截短突變體工程菌，具體為，將所構建的pET21a-pulA-N31表達載體(或連接產物)用熱激法轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，復蘇后將感受態細胞涂布在含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，培養12~16h ; 培養結束后，挑取LB平板上的陽性單克隆菌落，用菌落PCR篩選陽性克隆。同時接種到Amp終濃度為0.lmg/mL的液體LB培養基中，37°C、220 r/min培養12~16 h ;用solarb1質粒提取試劑盒提取質粒，并進行雙酶切驗證。(2)誘導表達，對步驟(I)中鑒定正確的陽性克隆接種到Amp和IPTG的終濃度分別是0.lmg/mL和0.6mmol/L的LB培養基中，進行誘導表達； (3)獲得酶pulA-N31，具體為， 取步驟(2)中菌液，4°C、6000 r/min、離心lOmin，收集菌體，加入I XE/ff (pH7.0)使菌體充分混勾，放置冰上進行超聲波破碎(3s X 4s X 99次)，4°C、6000 r/min，離心30min，將上清4°C保存； 將上述上清分裝到1.5mL的離心管中，4°C、12000 r/min離心30min，棄沉淀，上清液即為粗酶液； Co2+螯合瓊脂糖凝膠即可純化該粗酶液。上述含有普魯蘭酶產酶基因的載體、及含有普魯蘭酶產酶基因的載體在普魯蘭酶制備中的應用的過程，也即普魯蘭酶PU1A-N31的制備過程。由于從自然界篩選普魯蘭酶產生菌具有很大的盲目性，而且篩到的普魯蘭酶的酶活普遍較低，溫度和PH的作用范圍也不能滿足工業生產的需要。專利技術提供了一種普魯蘭酶產酶基因，同時利用基因工程操作手段提供了一種含有該基因的載體，將該載體用于普魯蘭酶制備后，與原始出發菌株變棲克雷伯氏菌HN7 {Klebsiella variicola HN7)相比，所制得的普魯蘭酶的比酶活、熱穩定性以及對普魯蘭糖的底物親和能力和催化效率都有了極大提高，顯現出較好地本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種普魯蘭酶產酶基因，其特征在于，與保藏編號CGMCC?NO.10357的變棲克雷伯氏菌HN7的野生型普魯蘭酶基因相比，其信號肽N端缺少31個氨基酸對應的堿基序列，具體序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王明道，郭雙，聶慧慧，張雨杭，焦國寶，陳曉慧，孫利鵬，邱立友，時延光，王紅陽，郜峰，原增艷，付香斌，
申請(專利權)人：河南仰韶生化工程有限公司，
類型：發明
國別省市：河南;41
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