本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于適配體識別表面增強拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌的方法。采用銀包覆金的核殼型納米材料作為基底，將巰基化修飾的沙門氏菌適配體加入到上述制備所得的銀包覆金的核殼型納米材料中孵育，從而將沙門氏菌適配體固定在基底上。將被測物與修飾有沙門氏菌適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加入具有拉曼信號ROX修飾的沙門氏菌適配體進行孵育，然后進行拉曼光譜掃描。基于適配體與沙門氏菌的特異性結(jié)合，實現(xiàn)對食品中沙門氏菌的檢測。本方法靈敏度高、特異性強、操作方便，在食品安全檢測領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于適配體識別表面增強拉曼光譜 檢測食品中沙門氏菌的方法。
技術(shù)介紹
沙門氏菌屬于一種腸道桿菌致病菌，革蘭氏陰性。沙門氏菌在自然界中廣泛存在， 特別容易污染水源、食品及畜產(chǎn)品，對于人類和動物的健康均構(gòu)成極大危害。人或動物食用 了被沙門氏菌污染的食品即會引發(fā)食物中毒。沙門氏菌引起的急性傳染病，臨床表現(xiàn)主要 分為胃腸炎型（即食物中毒）、傷寒型、敗血癥型及腸道外局灶性感染。其中以胃腸炎型最 為常見，可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉及發(fā)熱等臨床征候群。據(jù)資料統(tǒng)計，在我國細(xì)菌性食 物中毒中，70%~80%是由沙門氏菌引起的，世界各地的食物中毒中，美國、中國沙門氏菌 食物中毒居首位。由此可見沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上最為主要的人畜共患病之一。因此 建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的沙門氏菌檢測技術(shù)對于食品安全具有重要意義。 傳統(tǒng)的微生物檢驗程序繁瑣復(fù)雜，耗時費力，檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性在很大 程度上依賴于檢測者的專業(yè)素質(zhì)和經(jīng)驗，所以該方法不夠客觀、靈敏、快速；新發(fā)展起來的 熒光實時定量PCR技術(shù)，雖然能縮短檢驗時間，特異性強、靈敏度高，但是費用昂貴、易污 染，對操作環(huán)境要求高；現(xiàn)今常用的免疫學(xué)方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法、斑點酶聯(lián)免疫 吸附、免疫磁性分離技術(shù)，免疫熒光標(biāo)記等，具有特異性強、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點，但 制備抗體的時間比較長，成本高，且不穩(wěn)定。近些年來，由于適配體（aptamer)較之抗體有 諸多優(yōu)點：成本低，穩(wěn)定性好，易于修飾等等，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，受到 很多領(lǐng)域的關(guān)注。 拉曼散射由于蘊含分子振轉(zhuǎn)能級的豐富信息，已成為物質(zhì)分析的有力工具，特別 是表面增強拉曼散射（SERS)技術(shù)的出現(xiàn)，使其檢測靈敏度獲得了極大的提高。近年來， SERS光譜以其高分辨率、高靈敏度、溶液干擾性小、穩(wěn)定性好等特點被廣泛應(yīng)用于物理、材 料、表面科學(xué)、環(huán)境化學(xué)、生物化學(xué)、有機化學(xué)甚至生物學(xué)的分析和研究。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供一種基于適配體識別表面增強拉曼光譜檢測食品中沙門氏 菌的方法。本專利技術(shù)采用銀包覆金的核殼型納米材料作為基底，將巰基化修飾的沙門氏菌適 配體加入到上述制備所得的銀包覆金的核殼型納米材料中孵育，從而將沙門氏菌適配體固 定在基底上。將被測物與修飾有沙門氏菌適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加入 具有拉曼信號R0X修飾的沙門氏菌適配體進行孵育，然后進行拉曼光譜掃描。基于適配體 與沙門氏菌的特異性結(jié)合，實現(xiàn)對食品中沙門氏菌的檢測。具體檢測示意圖如圖1所示。本 方法靈敏度高、特異性強、操作方便，在食品安全檢測領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。 實現(xiàn)本專利技術(shù)的具體方法： ，包括以下步驟： 1) 拉曼增強基底的合成：采用檸檬酸三鈉還原法首先制備得到納米金，然后加入一定 量的抗壞血酸和硝酸銀，制備得到銀包覆金的核殼型納米材料基底。 2) 適配體的固定化：將一定量巰基化修飾的適配體加入到上述制備所得的銀包覆金 的核殼型納米材料中孵育，從而將適配體固定在基底上。 3) 沙門氏菌的檢測：將待測液與修飾有適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加 入一定量的具有拉曼信號ROX修飾的適配體，然后進行拉曼光譜檢測。 具體的：步驟1)所述拉曼增強基底的合成具體操作為，取0. 5mL 1 %的氯金酸溶 液，加入到49. 5mL超純水中，加熱并攪拌，至沸騰；然后迅速加入1. 5mL 1 %的檸檬酸三鈉 溶液，持續(xù)煮沸15min，合成納米金顆粒。接著取制備好的納米金2mL，加入lmL超純水， 0. 4mL L-抗壞血酸（0. lmol/L)，持續(xù)攪拌5min，逐滴加入1. 2mL硝酸銀（1 X 10 3mol/L)，持 續(xù)攪拌1小時，制備得到銀包覆金的核殼型納米材料。 步驟2)所述的適配體固定化操作為，取銀包覆金核殼型納米顆粒190 iiL，加入 10yL適配體（10ymol/L)，4°C孵育12小時。 步驟3)所述的檢測，不同濃度的沙門氏菌樣品與適配體修飾的銀包覆金核殼型 納米材料于室溫下孵育45min，然后加入R0X修飾的適配體繼續(xù)孵育45min。之后于3000r/ min離心5min，并清洗兩次。樣品重懸于緩沖液中上拉曼光譜儀檢測。 本專利技術(shù)的優(yōu)點在于： 1. 本專利技術(shù)方法以適配體作為識別元件，相比于免疫分析法中使用抗體作為識別元件， 適配體穩(wěn)定性好，制備成本低，易于標(biāo)記且標(biāo)記后不影響其活性，同時對目標(biāo)菌體具有高度 親和力和高度選擇性，在很大程度上提高了檢測的準(zhǔn)確性。 2. 本專利技術(shù)以銀包覆金的核殼型納米復(fù)合材料作為拉曼增強基底，具有貴金屬的光譜特 性，且試樣制備快速，成本低等優(yōu)點。 3. 本專利技術(shù)中提供的檢測方法與現(xiàn)有沙門氏菌的檢測方法相比，具有靈敏度高的特點， 其檢測限可達到17cfu/mL。【附圖說明】 圖1基于適配體識別表面增強拉曼檢測沙門氏菌的示意圖 圖2銀包覆金核殼型納米粒子的透射電子顯微鏡圖（TEM) 圖3不同濃度的沙門氏菌引起的表面增強拉曼光譜圖（A)，相對拉曼強度與沙門氏菌 濃度的線性關(guān)系圖（B)【具體實施方式】 為了使本專利技術(shù)所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實施方式】對本專利技術(shù)所述的 技術(shù)方案做進一步的說明，但是本專利技術(shù)不僅限于此。 實施例1 1)拉曼增強基底的合成 首先取0. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的氯金酸溶液于100mL圓底燒瓶中，加入超純水49. 5mL，加 熱并攪拌，至沸騰；然后迅速加入1. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)煮沸15min 后，溶液顏色變?yōu)榫萍t色，停止反應(yīng)，自然冷卻至室溫。接著取制備好的納米金2mL于50mL 圓底燒瓶中，加入lmL超純水，0. 4mL L-抗壞血酸（0. lmol/L)，室溫下持續(xù)攪拌5min，然后 逐滴加入1. 2mL硝酸銀（1 X 10 3m〇l/L)，持續(xù)攪拌1小時，溶液由酒紅色變?yōu)槌赛S色，終止 反應(yīng)，所得溶液為拉曼增強基底-銀包覆金核殼型納米顆粒。圖2為銀包覆金核殼型納米 顆粒的透射電子顯微鏡圖（TEM)當(dāng)前第1頁1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種基于適配體識別表面增強拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌的方法。其特征在于：采用銀包覆金的核殼型納米材料作為基底，將巰基化修飾的沙門氏菌適配體加入到上述制備所得的銀包覆金的核殼型納米材料中孵育，從而將沙門氏菌適配體固定在基底上。將被測物與修飾有沙門氏菌適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加入具有拉曼信號ROX修飾的沙門氏菌適配體進行孵育，然后進行拉曼光譜檢測。在一定濃度范圍內(nèi)，沙門氏菌的數(shù)量與拉曼信號強度呈正相關(guān)，以達到對沙門氏菌定量檢測的目的。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：段諾，張輝，吳世嘉，戴邵亮，王周平，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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