本發明專利技術公開了一種熒光定量PCR技術檢測β-酪蛋白基因型的方法，根據β-酪蛋白的堿基序列，設計出分別與A1型β-酪蛋白基因和A2型β-酪蛋白基因相匹配的兩組引物，然后將待測樣品分別與A1型引物組和A2型引物組進行PCR擴增，擴增過程中不同引物擴增得到的PCR產物會產生不同的熒光信號，隨著PCR反應的進行，PCR產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加，每經過一個PCR反應循環收集一次熒光信號，通過熒光信號的強度變化監測PCR產物量的變化，從而分別得到一條熒光信號強度曲線圖，根據兩個熒光信號的增強先后次序即可判斷出奶牛β-酪蛋白基因型。本發明專利技術提供的方法能檢測出不同的β-酪蛋白基因型，從而保證人們喝的牛奶為含有A2型β-酪蛋白的健康牛奶。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，主要涉及一種基因檢測方法，具體來說就是一種應用熒光定量PCR技術檢測奶牛不同β-酪蛋白基因型的方法。
技術介紹
牛奶中的蛋白質主要分為酪蛋白和乳清蛋白兩種。酪蛋白在牛奶蛋白中的含量約占80%左右，乳清蛋白約占14%。牛奶蛋白中一般含有四種酪蛋白，α S1-酪蛋白、a S2_酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白，其中β-酪蛋白約占酪蛋白總量的25?35%。酪蛋白中含有209個氨基酸，而它至少含有13種不同的氨基酸組成，因此分為A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、1、G。目前大多數養殖奶牛生產的酪蛋白，主要為Al和Α2兩種類型。Al和Α2 β -酪蛋白之間的主要區別是第67位氨基酸不同，Al β -酪蛋白的67位是組氨酸(密碼子為CAT)，A2 β -酪蛋白在同一位置是脯氨酸(密碼子為CCT)。在生物體內，β -酪蛋白會水解產生一類由4?11個氨基酸組成，起始氨基酸為酪氨酸的多肽——酪啡肽(BCM7) (Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-1le)就是從這類多肽中分離出來的一種類似嗎啡的活性肽，它能夠刺激淋巴T細胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由Al-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下產生，這是由于Α2-酪蛋白67位脯氨酸與其相鄰的66位和68位的氨基酸有比較穩定的二級結構，而Al-酪蛋白67位組氨酸與鄰近氨基酸的二級結構不穩定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能夠導致缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、I型糖尿病、新生兒猝死癥以及一些精神方面的疾病。Al β -酪蛋白的攝入與人類疾病之間的關系主要基于流行病學研究，Al β -酪蛋白與相關疾病的危險因素數據和死亡數據主要來源于世界衛生組織(WHO)。新西蘭流行病學證據表明A2牛奶比Al牛奶更有益于人類健康。McLachlan對16個國家30-69歲的男性中Al牛奶與心臟病發病率進行了調查，統計結果表明，缺血性心臟病與Al牛奶的消耗有很強的關聯性(s = 0.86)。Ell1tt比較了 10個國家0-14歲兒童I型糖尿病的發病率，Al β-酪蛋白與其有較大的關聯性(s = 0.726)，在冰島，由于當地的奶牛主要為Α2奶牛，所以該地糖尿病和心臟病的發病率很低。動物學實驗也表明表明，喂養Al牛奶的兔子與喂養Α2牛奶的兔子相比，膽固醇和血脂水平更高。因此，需要找到一種能夠有效區分分泌Al型β -酪蛋白和Α2型β -酪蛋白牛奶的奶牛的方法，從而使得養殖場只繁育能夠分泌Α2型β -酪蛋白的奶牛品種，保證我們喝的牛奶為含有Α2型β-酪蛋白的牛奶。但目前的檢測方法無法檢測出不同的酪蛋白基因型，不能保證人們喝的牛奶為含有Α2型β-酪蛋白的牛奶。
技術實現思路
鑒于目前還沒有一種有效檢測奶牛的β_酪蛋白基因型的方法存在的，本專利技術提供一種檢測出不同β_酪蛋白基因型的基于熒光定量PCR技術檢測β_酪蛋白基因型的方法。為達到上述目的，本專利技術的實施例采用如下技術方案:一種基于熒光定量PCR技術檢測β_酪蛋白基因型的方法，其包括以下步驟:根據酪蛋白的堿基序列，設計兩組不同的引物，其中一組引物的上游引物3’端和Al型的基因位點匹配，記為Al型引物；另一組引物的上游引物3’端和Α2型的基因位點匹配，記為Α2型引物，兩組引物的下游引物相同；其中，所述的Al型引物的上游引物為:5，CCT TCC CTG GGC CCA TTC A3’ ；所述Α2型引物的上游引物為5，CCT TCC CTG GGC CCA TTC C3，；Al型引物和Α2型引物的下游引物均為5’ GAT ATT TAG GGA AGG GCA ΤΤΤ3’ ；將待檢測的奶牛基因組DNA分別與Al型引物、Α2型引物在兩個反應體系中同時進行PCR擴增，擴增后每個樣品與每組引物產生一個熒光信號；監控熒光信號強度；將待檢測的奶牛基因組DNA分別與Al型引物、Α2型引物在兩個反應體系中同時進行PCR擴增，擴增后每個樣品與每組引物產生一個熒光信號，即每個樣品產生兩個熒光信號，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加，每經過一個PCR反應循環收集一次熒光信號，通過熒光信號的強度變化監測產物量的變化，根據兩個熒光信號的增強先后次序即可得出奶牛β -酪蛋白基因型，當Al型引物的熒光信號首先增強時，即可得出樣品DNA為Al型；當Α2型引物的熒光信號首先增強時，即可得出樣品DNA為Α2型；當Al型和Α2型引物的熒光信號同時增強時，即可得出樣品DNA為雜合型。作為優選方案，所述PCR擴增具體包括如下操作:取DNA 模板 I μ 1，加入 SYBR FAST qPCR Master MixlO μ 1、1pM 的上、下游引物各0.5?1.5ul，加雙蒸水至15?35ul得PCR擴增體系；將所述擴增體系加熱至92?95°C預變性I?5min，然后在90?95°C變性5?15s，60?65°C退火5?15s，70?75°C延伸30?50s，自變性開始至延伸結束記為一次循環，進行30?50次循環的操作。作為進一步優選方案，所述DNA模板的加量為I μ 1，所述SYBR FAST qPCR MasterMix的加量為10 μ 1，所述上、下游引物的濃度均為ΙΟρΜ，上、下游模板的加量均為1μ 1，加雙蒸水至20ul得PCR擴增體系；所述預變性的溫度為95°C，時間為2min，變性的溫度為94°C，時間為10s，退火的溫度為6rC，時間為10s，延伸的溫度72°C，時間為40s，循環的次數為40次。作為進一步優選方案，所述監控熒光信號強度具體為:每經過一個PCR反應循環收集一次熒光信號，通過熒光信號的強度變化監測產物量的變化并得到一條熒光信號強度曲線圖。本專利技術提供的基于熒光定量PCR技術檢測β_酪蛋白基因型的方法能檢測出不同的酪蛋白基因型，從而保證人們喝的牛奶為含有Α2型β-酪蛋白的牛奶。【附圖說明】為了更清楚地說明本專利技術實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為實施例1中樣品PCR過程中的熒光信號變化圖；圖2為實施例2中樣品PCR過程中的熒光信號變化圖；圖3為實施例3中樣品PCR過程中的熒光信號變化圖。【具體實施方式】下面將結合附圖對本專利技術作進一步說明。本專利技術中所用的奶牛基因組DNA樣本采自黑白花奶牛的血液，用目錄號為DP304的天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，提取步驟如下:一、提取實驗所需試劑和儀器移液器和槍頭、常溫離心機、組織破碎儀、加熱器或水浴、計時器、無水乙醇、2ml或1.5ml離心管。二、準備工作I)第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在緩沖液⑶和漂洗液PW中加入無水乙醇。2)樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。3)若緩沖液GA或GB中有沉淀，可在37°C水浴中重新溶解，搖勻后使用。4)將加熱器或水浴調到所需溫度(56°C，65°C，70°C )。三、操作步驟1、處理材料血液:取200μ I新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于熒光定量PCR技術檢測β?酪蛋白基因型的方法，其特征在于，包括以下步驟：根據β?酪蛋白的堿基序列，設計兩組不同的引物，其中一組引物的上游引物3’端和A1型的基因位點匹配，記為A1型引物；另一組引物的上游引物3’端和A2型的基因位點匹配，記為A2型引物，兩組引物的下游引物相同；其中，所述的A1型引物的上游引物為：5’CCT?TCC?CTG?GGC?CCA?TTC?A3’；所述A2型引物的上游引物為5’CCT?TCC?CTG?GGC?CCA?TTC?C3’；A1型引物和A2型引物的下游引物均為5’GAT?ATT?TAG?GGA?AGG?GCA?TTT3’；將待檢測的奶牛基因組DNA分別與A1型引物、A2型引物在兩個反應體系中同時進行PCR擴增，擴增后每個樣品與每組引物產生一個熒光信號；監控熒光信號強度；根據兩個熒光信號的增強先后次序即可得出奶牛β?酪蛋白基因型：當A1型引物的熒光信號首先增強時，即可得出樣品DNA為A1型；當A2型引物的熒光信號首先增強時，即可得出樣品DNA為A2型；當A1型和A2型引物的熒光信號同時增強時，即可得出樣品DNA為雜合型。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫子奎，高文學，丁方美，王鋒，方鈺，
申請(專利權)人：上海派森諾生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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