本文公開ChIP-seq的新穎方法。這些ChIP-seq方法使用載體DNA來防止DNA樣本損失。通過本發明專利技術實現的更高DNA產率允許對小數量細胞進行ChIP-seq，從而允許對有限數量的初級細胞進行表觀遺傳分析。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】專利
本專利技術涉及。背景染色質的表觀遺傳狀態調控轉錄因子和復制機構對DNA的接近。在真核生物中，調控細胞的表觀遺傳狀態的因素例如為DNA的甲基化作用和對組蛋白的共價修飾。下一代測序的發展已使得有可能使用染色質免疫沉淀法(ChlP-seq)來獲得整個基因組的表觀遺傳修飾的概況。ChlP-seq允許對結合至基因組的特定區域的蛋白質進行高分辨檢測，并且ChlP-seq可用于準確定位在細胞內導致表型改變的表觀遺傳修飾。表觀遺傳修飾是指對特定DNA序列和其相關組蛋白進行可逆的共價修飾。這些可逆的共價修飾影響如何利用基礎DNA，并因此還可控制性狀(Jenuwein和Allis (2001)Science，293，1074-1080 ;Klose 和 Bird(2006)Trends In B1chemical Sciences, 31,89-97)o對哺乳動物基因組的表觀遺傳修飾包括甲基化、乙?；?、核糖化、磷酸化、SUMO化修飾(sumoylat1n)、瓜氨酸化(citrullinat1n)和泛素化(ubiquitylat1n)。這些修飾可在核小體內的4個核心組蛋白的超過30個氨基酸殘基上發生。例如，對哺乳動物中DNA的大多數常見表觀遺傳修飾是對DNA的甲基化和羥甲基化，這兩者皆可在胞嘧啶嘧啶環的第5個碳上進行。對基因組的表觀遺傳修飾可如基因組誘變一般深刻地影響發育和健康。特定而言，上文所述的表觀遺傳修飾不改變一級DNA序列。相反地，該表觀遺傳修飾對基礎DNA如何表達具有有效影響。因此，表觀遺傳修飾可如DNA序列中的突變一般有力地改變表現型。例如，pl6腫瘤校正基因的突變(S卩，核苷酸序列中的突變)使該基因沉默。類似地，在P16腫瘤校正基因的啟動子上的DNA甲基化(S卩，核苷酸序列無突變)使該基因沉默。這兩個事件(即，核苷酸序列的突變和正確序列的甲基化)皆有助于結腸直腸癌的發生和進展。然而，與永久性突變不同，P16的表觀遺傳沉默在藥理學上可逆。因此，檢測出表觀遺傳修飾的能力提供一種用于醫療干預和直接治療方案的途徑。全基因組(genome wide)發生的特定表觀遺傳修飾也在發育期間調控細胞分化(Mikkelsen等人(2007)Nature，448，553-U552)。例如，成熟組織中的表觀遺傳修飾有助于癌癥和其他疾病的引發和進展(Feinberg，A.P.(2007)Nature，447，433-440)。另夕卜，研究已表明表觀遺傳修飾受到環境變量的影響，所述環境變量包括飲食(Waterland和 Jirtle (2003) Molecular And Cellular B1logy，23，5293-5300)，環境毒素(Anway等人(2005)Science，308，1466-1469)以及母性行為(Weaver 等人(2004)NatureNeuroscience，7，847-854)?？紤]到表觀遺傳修飾在正常發育、環境響應、疾病發生和疾病進展中起到的基本作用，需要研發對基因組DNA進行測序以檢測表觀遺傳修飾的方法。特定而言，需要研發對基因組DNA進行測序來從可由簡單活檢或組織樣本獲得的小數量細胞中檢測出表觀遺傳修飾的方法。此外，即使表觀遺傳修飾未由DNA序列的改變組成，所述表觀遺傳修飾仍可在有絲分裂期間從母細胞傳遞給子細胞，并且可從一代到下一代經由減數分裂持續傳播。因此，即使表觀遺傳修飾可遠比DNA序列的改變更容易地改變并回復其初始狀態，但其仍對發育和疾病很重要。因為表觀遺傳修飾涉及癌癥發展和癌癥進展，已對其進行格外研究。例如，與對人結腸直腸癌發展進行DNA甲基化時的擾動相關的早期觀察以及后續研究表明DNA甲基化狀態的實驗操作在藥理學或遺傳學上有能力控制腫瘤發展。因此，愈來愈多研究表明針對表觀遺傳狀態修改的治療可控制癌癥和疾病進展。同樣地，可針對疾病狀態對表觀遺傳修飾進行定位，并且表觀遺傳修飾可用作生物標志物來檢測或預防疾病發生和進展。表觀遺傳修飾的其他實例為響應于有機體環境而發展的那些表觀遺傳修飾(例如，人類生活的地方以及在周圍環境中人類所暴露于的具體內容可能影響表觀遺傳修飾)。影響表觀遺傳的環境因素的實例包括養育期間的母性行為、暴露于內分泌干擾物以及食物的營養構成。此外，如上所述，表觀遺傳修飾和所得表現型可從父母傳播給后代，即便僅父母而非后代暴露于所述環境因素。這引起以下可能:家族中存在的一些復雜性狀(如肥胖、癌癥或行為模式)通過表觀遺傳修飾來傳播，并且所述復雜性狀是由前代所經歷的暴露環境因素所導致。分析染色質的表觀遺傳修飾的現有方法，諸如染色質免疫沉淀法(ChIP)，是勞動密集性的并且需要系列過程，所述系列過程對分析通量和樣本數量構成顯著限制。ChIP涉及免疫沉淀法，其使用對所關注表觀遺傳修飾具有特異性的抗體來分離經過修飾的染色質，該染色質隨后用大規模平行DNA測序(ChlP-seq)、微陣列雜交或基因特異性PCR來分析。ChIP可用于表征染色質相關蛋白質的基因組分布(genome placement),并且是目前實踐用于表觀遺傳和染色質研究的主要分析工具。然而，其具有較大局限。首先，該分析一般需要至少17個細胞。換句話說，當細胞數目有限時，目前的ChIP方法需要的細胞遠多于可用的細胞。例如，不可能在胚胎上、在體外培養中未繁殖的初級細胞上、在顯微切割細胞上以及在從活體動物諸如人類的活檢中直接獲取的小細胞樣本上執行ChlP-seq。因此，表觀遺傳測試的目前方法涉及巨量細胞分析(即，平均至少16個細胞)。單個哺乳動物細胞中RNA和DNA的全基因組測序對以精確度揭示全面轉錄計劃(global transcript1nal program)和DNA變異來說擁有巨大前景。然而，重要的缺失環節是該基因組在從組織分離的小數量細胞(例如小于16個細胞，例如I個至20，000個細胞之間)中的表觀遺傳和轉錄因子結合性圖譜的信息。獲得用于深度測序的DNA所需的多個步驟限制了染色質免疫沉淀法(ChIP)的應用，因為深度測序通常需要不能利用傳統ChIP方法采集的大數量DNA (即，因為ChIP需要大量純化步驟，通常損失大數量DNA)。本文所述的是一種基于DNA強化回收的新方法。特定而言，本文提供的方法描述通過添加保護劑以及有利的DNA擴增(RepFamp)來在ChIP期間加強DNA回收(S卩，防止純化和加工步驟中的DNA損失)。所述方法允許在極小數量的細胞中對表觀遺傳圖譜進行穩健且可靠的定位，并且產生一種不用細胞計數來揭露表觀遺傳改變而進行全面轉錄組分析的新型和新穎方法。專利技術概述本專利技術涉及對來自細胞的樣本的基因組DNA進行測序的方法，并且所述方法包括:對細胞的所述樣本中的染色質進行斷裂；將載體DNA加入細胞的所述樣本的所述斷裂染色質中，其中所述載體DNA (稱為“DNA1 ”)是5’生物素化DNA ;使載體DNAl和斷裂染色質的混合物沉淀；使阻斷引物退火，所述阻斷引物防止DNA擴增并且與所述DNAl互補；對來自細胞的樣本的基因組DNA進行擴增；以及對擴增DNA進行測序。在I個至20，000個細胞的細胞樣本上執行所述方法。本專利技術涉及對來自細胞的樣本的基因組DNA進行測序的方法，并且所述方法包括:對本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種對來自細胞的樣本的基因組DNA進行測序的方法，所述方法包括：a.對細胞的所述樣本中的染色質進行斷裂，b.將載體DNA加入細胞的所述樣本的所述斷裂染色質中，其中所述載體DNA是5’生物素化DNA(“DNA1”)，c.使載體DNA和斷裂染色質的混合物沉淀，d.使與所述DNA1互補的阻斷引物退火，e.使來自細胞的所述樣本的所述基因組DNA擴增，以及f.對所述擴增DNA進行測序；其中細胞的所述樣本包括1個至20,000個細胞，以及其中所述阻斷引物防止所述DNA1擴增。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭詣先，J·賈，X·鄭，
申請(專利權)人：卡耐基華盛頓學院，
類型：發明
國別省市：美國;US
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。