本公開涉及變體因子VIII多肽，其在凝血酶切割位點和活化環之一或兩者中的一個或多個位置處包含氨基酸取代。在某些實施方案中，該變體因子VIII多肽包含在凝血酶切割位點和活化環兩者中的一個或多個氨基酸取代。在進一步的實施方案中，所述變體因子VIII多肽還包含在A1-A2域界面和A2-A3域界面內的一個或多個氨基酸取代。本公開還涉及產生和/或使用這類變體因子VIII多肽的方法：編碼該多肽的核酸；含有這類核酸的載體和/或重組細胞、組織或生物體；和含有這類多肽和/或核酸的試劑盒和藥物組合物。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】變體因子Vl I I多肽及其產生和使用方法 對相關申請的交叉引用 本申請要求2013年3月15號提交的美國臨時申請No. 61/789, 112的權益，其通 過提述完整并入本文。 專利
本文中提供了人凝固因子VIII變體和編碼這類變體的多核苷酸，包含和表達這 類變體的載體和宿主細胞，獲得這類變體的方法，使用這類變體的方法，變體的組合物，和 與其相關的另外的專利技術特征。 專利技術背景 血液凝固是由多種血液組分（或因子）之間復雜的相互作用組成的逐漸導致纖 維蛋白凝塊形成的過程。通常參與被常稱為凝固"級聯反應"的血液組分是不具有酶活性 的蛋白（原酶或酶原），通過激活劑的作用使其轉化為蛋白水解酶，所述激活劑本身常常是 激活的凝固因子。對凝固級聯反應關鍵性的一種肽是因子VIII或FVIII。事實上，最常見 的遺傳性凝血病癥血友病A是由因子VIII中的缺陷或結構性缺陷導致的。因子VIII的 生物化學允許針對凝固的快速打開/關閉轉換。它作為無活性的輔因子循環，通過凝血酶 (凝固級聯反應的倒數第二個酶）被活化為FVIIIa。FVIIIa與FIXa、膜或磷脂（PL)表面 和Ca+2-起參與一種短壽命的酶復合物（FXase)以將FX轉化成FXa。FVIIIa作為FXase 復合物中的參與者的主要功能是突出地增多FXa，由此允許凝血酶生成。因子VIII由~ 186kb基因編碼，該基因由26個外顯子組成（Thompson, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 29:11-22 (2003)(參考文獻11和16-18))。該基因的mRNA的翻譯繼之以19個 氨基酸的信號序列的除去，產生2332個氨基酸的成熟蛋白質。該蛋白由6個主要域組成， 其從氨基末端為：AU A2、B、A3、Cl和C2。涉及活化的另外的短酸性區域al、a2和a3分別 散布在Al和A2、A2和B、和B和A3域之間。這一 2332個氨基酸的主要翻譯產物被加工成 異二聚體，其由異質性重鏈（含有完整的Al，alA2，a2域和多種長度的B域）和同質性80kD 輕鏈（含有a3、A3、Cl和C2域）組成。B域的異質性來自分泌期間的蛋白水解。 因子VIII到因子VIIIa的活化一般經由通過凝血酶對原輔因子（procofactor) 的蛋白水解而發生。凝血酶識別限定沿因子VIII肽鏈的凝血酶切割位點的特定氨基酸區 域。因子VIII具有3個凝血酶切割位點。對其他凝血酶底物的檢查揭示了可被凝血酶容納 的多個殘基。盡管在這些凝血酶切割位點內的氨基酸可在一定程度上變化，但某些氨基酸 比之其他氨基酸在這些切割位點內要更常見得多，且某些氨基酸殘基引起凝血酶對該肽的 更有效的切割。（參見例如Newell-Caito 等，"P3_P3'Residues flanking Scissile Bonds in Factor VIII Modulate Rates of Substrate Cleavage and Profactor Activation by Thrombin1Tiochemistry 51:3451-59(2012) ;Gallwitz 等，"The Extended Cleavage Specificity of Human Thrombin,'TLoS ONE 7:e31756(2012))。因子 VIII 中的 3 個凝血 酶切割位點之一位于或接近al-A2接合處，其位于或接近成熟野生型人因子VIII肽的氨基 酸位置370-375處。 在切割后，活性因子Villa是包含Al亞基、A2亞基和A3C1C2亞基的異三聚體。該 異三聚體由在亞基彼此相互作用所在區域處的亞基之間的靜電和疏水性相互作用兩者支 持，所述區域稱為"域界面"。已知該異三聚體包含至少A1-A2和A2-A3域界面。（參見例 如美國專利吣.8,338,571(2008年7月25日提交）（2012年12月25日授權））。 人因子VIII被重組生產為約300kD的單鏈分子。該前體產物在高爾基體（Golgi Apparatus)中被加工成200kD(重鏈）和80kD(輕鏈）的兩條多肽鏈，這兩條鏈通過金 屬離子被保持在一起（Kaufman 等，J. Biol. Chem. 263:6352 (1988) ;Andersson 等，Proc. Natl.Acad. Sci.83:2979(1986))。FVIII的B域似乎是可有可無的，因為B域缺失的 FVIII (FVIII-BDD ;90kD A1-A2重鏈加80kD輕鏈）已顯示為是血友病A的有效替換療法。 稱為"BDD-SQ"或簡稱為"BDD"的一種公知的B域缺失的因子VIII序列含有除14個氨基 酸以外的B域全部缺失。 對血友病A的治療目前涉及按需要或作為防護療法靜脈內（iv)施用因子VIII。盡 管對于全長蛋白其有超過300kD的較大大小，但因子VIII在人中的半衰期僅為約11小時。 (Ewenstein等，Semin. Hematol. 41:1-16(2004))。因此，必須相對頻繁地施用因子VIII以 用于對凝血病癥的防護性治療。因子VIII通常每周施用兩至三次，給藥基于因子VIII活 性。這種對頻繁iv注射的需要給患者依從性創造了巨大的障礙。如果能開發出不需要那 么頻繁施用的因子VIII產品，對于患者將是更方便的。此外，降低需要的劑量數目也會降 低治療的成本。另外，即使使用這些頻繁施用，由于其短半衰期，進行因子VIII替換療法的 患者也經常在血漿因子VIII活性水平中產生較大的擺動，從而給其帶來潛在的血栓癥（在 峰值水平）和出血（在低谷水平）的風險。 另外，備選的非iv施用路徑如皮下（SC)施用可以通過將血漿因子VIII水平維持 在更恒定的水平既增加治療的容易性又降低血栓癥和出血的潛在風險。Sc投遞的一項挑 戰是增加施用的因子VIII的生物利用度。具有增強的活性的因子VIII肽可能對于增強 生物利用度有用，因此可能可用于因子VIII的SC投遞。由于其較高的比活性（specific activity)，這類因子VIII肽可能允許施用所需體積的減少，因為藥物的活性濃度更高。降 低的注射體積能減少患者不適。此外，體積降低還將轉化成貨品成本的降低。最后，增強的 活性因子VIII分子還能賦予在野生型因子VIII之上的額外保護，其通過延長輔因子活性 的持續時間（如果給藥是通過質量（mass)而非通過活性的話）。例如，在等質量給藥時，具 有2倍比活性增強的增強活性的FVIII變體在0. 5%水平將提供與野生型FVIII在1 %水 平所提供的相同的保護，由此延長因子VIII劑量之間的時間間期。 已生成大量因子VIII變體以試圖解決當前醫學療法的一個或多個缺點。例 如，美國專利No. 8,338,571 (2008年7月25日提交；2012年12月25日授權）描述了一 種重組因子VIII，其包含一個或多個導致因子VIII和因子VIIIa兩者的增強的穩定性 的突變。類似地，美國專利公開No. 2012/0190623(2011年1月27日提交）描述了對失 活抗性的因子VIII突變體，包括"其中APC切割位點本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種因子VIII多肽的變體，其中所述因子VIII多肽是包含氨基酸位置370?375處的凝血酶切割位點和氨基酸位置558?565處的活化環的功能性因子VIII，其中所述氨基酸位置編號依照SEQ?ID?NO:1中列出的氨基酸序列；且其中所述變體包含在所述凝血酶切割位點內一個或多個殘基處的氨基酸取代和在所述活化環內一個或多個殘基處的氨基酸取代。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：U格里特贊，P克雷奇默，L萊昂格，C帕特爾，
申請(專利權)人：拜耳醫藥保健有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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