一種檢測微生物的方法技術

本發明專利技術涉及食品安全檢測領域，公開了一種檢測微生物的方法，包括：1)將免疫磁球與液體形式的待測樣品進行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當待測樣品中存在微生物時，免疫磁球能夠特異性地結合所述微生物，所述能夠特異地與微生物結合的免疫磁球由抗體與磁球偶聯得到；2)將所述混合后的物料置于分選磁場中進行磁分離，除去未結合在免疫磁球上的物質；3)重懸磁分離得到的沉淀物，并將得到的重懸液進行核磁共振而檢測橫向弛豫時間，根據橫向弛豫時間判斷待測樣品中的微生物的含量。本發明專利技術能夠快速有效地檢測樣品中微生物(特別是細菌、真菌或病毒等)的含量，操作簡單易行且特異性強、靈敏度高，在痕量微生物檢測領域極具應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及食品安全檢測領域，具體地，涉及一種檢測微生物(特別是有害微生物)的方法。
技術介紹
食品安全是重大民生問題。食源性微生物致病菌有效的監測對于首都食品質量控制和監管尤為重要。針對食品中的病原微生物(如細菌、真菌和病毒等)以及其他有害生物(如寄生蟲)，傳統的檢測方法為分離培養法。分離培養需要前增菌、增菌、生化鑒定或血清學鑒定，整個檢測過程需要2-3天甚至5-6天的時間才能完成，而且檢測過程中所需的培養基準備、平板培養、菌落計數、生化鑒定等使得檢測任務勞動強度大，耗時，不能及時、快速評價食品中微生物的安全性，不利于監管部門對問題食品的快速反應。傳統檢測病原微生物方法步驟多，所需時間長，速度慢，難以適應食品快速流通檢測的需要；現代微生物檢測方法雖然檢測速度快，但是在細菌濃度較低的情況下容易造成漏檢，靈敏度低。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種操作簡單、檢測時間短、靈敏度高的檢測微生物的方法。本專利技術的專利技術人進行了大量的研究，發現配合使用免疫磁分離技術與核磁共振技術即可實現微生物的高靈敏度檢測。因此，為了實現上述目的，本專利技術提供了，該方法包括以下步驟:(I)將免疫磁球與液體形式的待測樣品進行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當待測樣品中存在微生物時，免疫磁球能夠特異性地結合所述微生物，所述能夠特異地與微生物結合的免疫磁球由抗體與磁球偶聯得到；(2)將所述混合后的物料置于分選磁場中進行磁分離，除去未結合在免疫磁球上的物質；(3)重懸磁分離得到的沉淀物，并將得到的重懸液進行核磁共振而檢測橫向弛豫時間，根據橫向弛豫時間判斷待測樣品中的微生物的含量。通過上述技術方案，本專利技術能夠快速有效地檢測樣品中微生物(特別是細菌、真菌或病毒等)的含量，操作簡單易行且特異性強、靈敏度高，在痕量微生物檢測領域極具應用前景。本專利技術的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。【附圖說明】附圖是用來提供對本專利技術的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本專利技術，但并不構成對本專利技術的限制。在附圖中:圖1是按照本專利技術的一種實施方式測得的微生物的含量與Λ!^值之間的關系圖；圖2是按照本專利技術的另一種實施方式測得的微生物的含量與ΛT2值之間的關系圖；圖3是按照本專利技術的另一種實施方式測得的微生物的含量與ΛT2值之間的關系圖。【具體實施方式】以下對本專利技術的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。在本專利技術中，在未作相反說明的情況下，使用的單位“CFU/mL”意指以每毫升待測樣品為基準的菌株的CFU數；使用的術語“免疫磁球”是指通過偶聯反應將抗體結合到磁性微球(或磁球)的表面上，形成的免疫磁性微球；術語“橫向弛豫時間”是指兩個處在一定距離內，進動頻率相同、進動取向不同的核互相作用，交換能量，改變進動方向所需的時間稱為橫向弛豫時間(或自旋-自旋弛豫時間，T2);本專利技術中使用的液體體積均為20°C下的數值；涉及的術語“室溫”指室內溫度，通常為5-40°C。本專利技術提供的檢測微生物的方法包括以下步驟:(I)將免疫磁球與液體形式的待測樣品進行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當待測樣品中存在微生物時，免疫磁球能夠特異性地結合所述微生物，能夠特異地與微生物結合的免疫磁球由抗體與磁球偶聯得到；(2)將所述混合后的物料置于分選磁場中進行磁分離，除去未結合在免疫磁球上的物質；(3)重懸磁分離得到的沉淀物，并將得到的重懸液進行核磁共振而檢測橫向弛豫時間，根據橫向弛豫時間判斷待測樣品中的微生物的含量。本專利技術的檢測方法優選為體外檢測方法。根據本專利技術，所述微生物可以為各種常見的微生物，特別是有害微生物(或致病菌)，如細菌、真菌或病毒。所述抗體可以根據微生物的具體種類進行選擇，只要能夠特異性地結合所述微生物從而實現免疫磁分離即可。優選情況下，所述微生物為沙門氏菌(Salmonella)，所述抗體為編號為01-91-99的KPL多克隆抗體。根據本專利技術，抗體與磁球偶聯獲得所述免疫磁球(或免疫磁珠)的方法可以為常規方法，例如，可以按照文獻(劉輝榮等，簡便高效分離細胞新型免疫磁珠制備，中國公共衛生，2008，11:1349-1351)中的方法進行。優選地，相對于每克的磁球，所述抗體的用量為10-150mg(更優選為10mg、30mg、50mg、70mg、80mg、90mg、95mg、lOOmg、105mg、llOmg、120mg、140mg、150mg、或者上述任意兩個數值之間的范圍)。優選地，相對于每毫升的液體形式的待測樣品，所述免疫磁球的用量為100-600 μ g(100 μg、200 μ g、300 μg、380 μg、390 μ g、400 μg、410 μg、420 μ g、450 μg、500 μ g、550 μ g、600 μ g或者上述任意兩個數值之間的范圍)。所述磁球可以為各種常規用于免疫磁分離的磁球，例如，可以為表面修飾羧基的聚乙二醇(PEG)包裹的Fe3O4復合微球和/或表面修飾有羧基的葡聚糖包裹的Fe 304復合微球。所述磁球可以通過商購獲得，例如，Micromod有限公司的79-56-201、79-56-102和79-56-501中的至少一種。優選情況下，所述磁球的粒徑為10-200nm(如 10nm、20nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、90nm、lOOnm、llOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm或者上述任意兩個數值之間的范圍)。根據本專利技術，步驟(I)中，對所述混合的條件沒有特別的要求，只要能夠使微生物被所述免疫磁球特異性地結合即可。所述混合的條件可以包括:溫度為室溫，時間為25-35min。混合可以在磷酸鹽緩沖液中進行，所述磷酸鹽緩沖液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氫二鈉和0.038-0.056mol/L的磷酸二氫鈉。根據本專利技術，置于分選磁場中進行的磁分離可以借助免疫磁分離系統(例如磁力架或Matrix Pathatrix免疫磁分離系統)進行，對所述磁分離的條件沒有特別的限定，優選地，步驟(2)中，所述磁分離的條件包括:溫度為室溫，時間為25-35min。根據本專利技術，步驟(3)中，本領域技術人員能夠對重懸所用溶液的用量進行選擇，例如，相對于每毫克的沉淀物，重懸所用溶液的用量為0.5-1.5mL。重懸所用的溶液可以為常規的用于懸浮免疫磁球的溶液，優選為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氫二鈉和0.038-0.056mol/L的磷酸二氫鈉。步驟(I)中優選使用的磷酸鹽緩沖液與步驟(3)中優選使用的磷酸鹽緩沖液可以相同或不同。根據本專利技術，所述核磁共振的條件包括:掃描次數(scans)為4_8次，重復延遲時間(recycle delay)為1.5_2.5s，接收機放大倍數(gain)為50_60dB，重復測量時間(repetit1n time)為 1s0本專利技術中，核磁共振檢測的Λ 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測微生物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：(1)將免疫磁球與液體形式的待測樣品進行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當待測樣品中存在微生物時，免疫磁球能夠特異性地結合所述微生物，所述能夠特異地與微生物結合的免疫磁球由抗體與磁球偶聯得到；(2)將所述混合后的物料置于分選磁場中進行磁分離，除去未結合在免疫磁球上的物質；(3)重懸磁分離得到的沉淀物，并將得到的重懸液進行核磁共振而檢測橫向弛豫時間，根據橫向弛豫時間判斷待測樣品中的微生物的含量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜美紅，代鳳英，楊寅，許迪莘，張淼，
申請(專利權)人：北京市理化分析測試中心，
類型：發明
國別省市：北京;11