一種豬偽狂犬病毒株制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種豬偽狂犬病毒株，其特征在于：豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC?NO：V201314。本發(fā)明專利技術(shù)將PRV/HN2012株傳至第7代，并對第7代病毒進行了病毒滴度TCID50的測定，結(jié)果TCID50為109.0。并將PRV/HN2012株接種小鼠，攻毒24h后，PRV/HN2012株感染組小鼠即出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，攻毒48h后，小鼠全部死亡，表明該毒株具有很強的毒性。基于此，通過對PRV/HN2012株理化特性研究，結(jié)果表明該毒株對分析純氯仿敏感，屬于有囊膜病毒；對酸、堿有較強的抵抗力，pH3.0的鹽酸、pH11.0的NaOH處理1h使其失活；對熱有較強抵抗力，56℃水浴處理1h才能失活；對胰蛋白酶敏感，紫外線處理30min，對其感染性影響不明顯。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種豬偽狂犬病毒株
本專利技術(shù)涉及一種豬偽狂犬病毒毒株。
技術(shù)介紹
偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(PRV)所引起的家畜和多種野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)及腦脊髓炎為主要癥狀的一種急性傳染病。該病1813年首見于美國，由于其臨床表現(xiàn)與狂犬病類似，故稱為偽狂犬病。1902年，匈牙利學者Aujeszky首先報道了該病，因此該病亦被命名為Aujeszky氏病。豬是該病的自然宿主和主要傳染源，PRV可以感染不同年齡段的豬，但以妊娠母豬和哺乳仔豬感染最為嚴重：導致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎以及木乃伊胎；初生仔豬出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，多為急性致死性經(jīng)過，死亡率幾乎高達100％。該病廣泛分布于世界各國。我國劉永純1947年首先從貓體內(nèi)分離到該病毒。該病在我國流行已相當廣泛，許多豬場發(fā)生過此病，是母豬繁殖障礙、仔豬死亡率高的主要原因之一。特別是近些年，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化、規(guī)模化的發(fā)展，豬偽狂犬病在不少地區(qū)暴發(fā)流行，并有逐漸擴大蔓延的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。自發(fā)現(xiàn)本病以來，已對其進行了極其廣泛的研究，并取得了很大進展，目前很多國家已成功根除或控制了該病，對該病的研究和防控也已成為研究分子病毒學和成功控制病毒病的典范。在生產(chǎn)實踐中，主要依靠疫苗尤其是基因工程缺失疫苗對PR進行防制，從而使該病得到有效控制。2012年春季以來，在河南、吉林、黑龍江等多地區(qū)使用PRV基因缺失苗免疫的豬場出現(xiàn)疑似PR病例，母豬產(chǎn)弱仔、死胎或木乃伊胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、死亡，死亡率達10％～50％，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。因此從河南免疫豬場送檢的臨床樣品中，分離并鑒定PRV河南流行株，闡明河南省豬群中PRV流行毒株的遺傳變異情況，并進行相關(guān)生物學特性研究就顯得尤為重要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種豬偽狂犬病毒株，分類命名：皰疹病毒科豬皰疹病毒I型豬偽狂犬病毒PRV／HN2012，拉丁文學名：Herpesviridae。保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡稱：CCTCC，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學，保藏日期：2013年5月28日，保藏編號CCTCCNO：V201314。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是：一種豬偽狂犬病毒株，豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCCNO：V201314。本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)將PRV/HN2012株傳至第7代，并對第7代病毒進行了病毒滴度TCID50的測定，結(jié)果TCID50為109.0。并將PRV/HN2012株接種小鼠，攻毒24h后，PRV/HN2012株感染組小鼠即出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，攻毒48h后，小鼠全部死亡，表明該毒株具有很強的毒性。基于此，通過對PRV/HN2012株理化特性研究，結(jié)果表明該毒株對分析純氯仿敏感，屬于有囊膜病毒；對酸、堿有較強的抵抗力，pH3.0的鹽酸、pH11.0的NaOH處理1h使其失活；對熱有較強抵抗力，56℃水浴處理1h才能失活；對胰蛋白酶敏感，紫外線處理30min，對其感染性影響不明顯(表1)。這些理化特性均符合豬偽狂犬病毒的理化特性。經(jīng)電鏡觀察，可看到大小均一、近似圓形的病毒粒子，大小約110～150nm，囊膜表面有呈放射狀排列的纖突，與已報道的PRV形態(tài)基本吻合。因此，本專利技術(shù)成功分離出PRV/HN2012株，并對PRV/HN2012株進行了理化特性試驗和形態(tài)學觀察，為控制豬偽狂犬病在河南的流行提供了理論依據(jù)。附圖說明圖1為組織病料中PRV的PCR擴增結(jié)果,M.DNAMarkerDL2000；1-9.病料中PRV的PCR產(chǎn)物；10.陰性對照。圖2為感染分離毒PRV的ST細胞(100×),A.正常的ST細胞對照；B.分離毒PRV感染的ST細胞。圖3為PRVgE基因擴增結(jié)果,M.DNAMarkerDL2000；1-3.PCR產(chǎn)物；4.陰性對照。圖4為PRVPRV/HN2012株電鏡照片。圖5為PRVgE全基因擴增結(jié)果,M.DNAMarkerDL2000；1-4.PCR產(chǎn)物；5.陰性對照。圖6為重組質(zhì)粒PCR鑒定,M.DNAMarkerDL2000；1-9.PCR產(chǎn)物；N.陰性對照。圖7為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖,M.DNAMarkerDL5000；1-3.重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切產(chǎn)物；4.空載質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物(陰性對照)。圖8為PRV不同分離株gE全基因的核苷酸序列同源性分析。圖9為PRVgE基因推導的氨基酸序列的比較。圖10為PRV分離株gE基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹。圖11為PRVgC基因的PCR擴增,M.DNAmarkerDL2000；1.PCR產(chǎn)物；2.PCR產(chǎn)物；3.陰性對照。圖12為重組質(zhì)粒PCR鑒定,M.DNAMarkerDL2000；1-4.PCR產(chǎn)物；5.陰性對照。圖13為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖,M.DNAMarkerDL5000；1-2.空載質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物(陰性對照)；3-4；重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切產(chǎn)物。圖14為PRV不同分離株gC全基因的核苷酸序列同源性分析。圖15為PRVgC基因推導的氨基酸序列同源性分析。圖16為PRV分離株gC基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹。具體實施方式一種豬偽狂犬病毒毒株，分類命名：皰疹病毒科豬皰疹病毒I型豬偽狂犬病毒PRV／HN2012，拉丁文學名：Herpesviridae。保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡稱：CCTCC，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學，保藏日期：2013年5月28日，保藏編號CCTCCNO：V201314。本專利技術(shù)采用PCR方法對河南采集的疑似PR的病料進行PCR檢測，通過接種豬睪丸(ST)細胞分離到1株病毒，命名為HN2012。通過觀察細胞病變、生物學特性研究、電鏡觀察病毒的形態(tài)等途徑證實分離病毒為豬偽狂犬病毒。將PRV/HN2012株病毒液，經(jīng)甲醛滅活后與弗氏佐劑混合制成油乳劑，接種健康6周齡雌性昆明小鼠，同時設置Bartha-K61疫苗株商品苗、湖北98疫苗株商品苗免疫組以及陰性對照組，28d后采血分離血清，分別進行血清中和試驗，檢測中和抗體水平，并用PRV/HN2012株進行攻毒保護試驗，結(jié)果PRV/HN2012株滅活油乳劑免疫組小鼠完全保護，表明PRV/HN2012具有良好的免疫原性。一、豬偽狂犬病毒PRV/HN2012的分離鑒定和生物學特性研究1材料與方法1.1材料1.1.1組織病料、細胞株及實驗動物病料來源于河南PR免疫豬場疑似PRV感染的臨床發(fā)病樣品，于2013年3月采集，包括病死仔豬的腦、肝臟、脾臟和淋巴結(jié)。豬睪丸(ST)細胞購自中國獸藥監(jiān)察所，由本專利技術(shù)室凍存。6周齡雌性昆明小鼠購自河南省實驗動物中心。1.1.2主要試劑PrimeGXL酶、EXTaq酶、DNAMarkerDL2000等購自大連寶生物工程有限公司；RPM-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶等購自索萊寶科技有限公司。瓊脂糖購自Promega公司；蛋白酶K購自華美生物工程公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、飽和酚、氯仿、異戊醇購自上海生物工程有限公司。1.2引物設計參照GenBank中發(fā)表的PRVgH（X61696）、gE（AF本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種豬偽狂犬病毒株，其特征在于：豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC?NO：V201314。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種豬偽狂犬病毒株（PseudorabiesViru...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳紅英，楊明凡，高曉云，崔保安，楊興武，張宇，徐朋麗，
申請(專利權(quán))人：河南農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：河南;41