一種檢測魚腥藻磷代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量引物及應(yīng)用與方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測魚腥藻磷代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的引物及應(yīng)用與方法，該引物為以下兩對(duì)引物中的一對(duì)或兩對(duì)，核苷酸序列為pstl-F：GCCACAGCTCAAGCTCAAAC；pstl-R：CCCACCACCACTACCAATCC；或phoAlike-F：GTGGCTGGAGCAAGAACTTA；phoAlike-R：CAGCATCTTGAGGGTTGTGT。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了所述引物的應(yīng)用，即通過檢測魚腥藻磷代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來測定水體生物有效磷含量；并開發(fā)了基于磷代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量獲得水體生物有效磷含量的測定方法，將為我國環(huán)境監(jiān)測和管理部門在水體富營養(yǎng)化監(jiān)測與水華爆發(fā)預(yù)警等領(lǐng)域的科技應(yīng)用和技術(shù)提升提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體設(shè)及一種檢測魚腥藻FACHB-1299憐代謝相關(guān)酶 基因表達(dá)量引物及應(yīng)用與方法。
技術(shù)介紹
藍(lán)藻是一類古老的具有放氧光合作用的革蘭氏陰性細(xì)菌，在漫長的自然選擇過程 中進(jìn)化出獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)能力，廣泛分布于不同的生境中。藍(lán)藻對(duì)不利的環(huán)境因子，如溫度 變化、營養(yǎng)（如氮源和憐源等）缺乏、氧化脅迫等，產(chǎn)生的特異性應(yīng)答反應(yīng)是藍(lán)藻適應(yīng)多變 的環(huán)境、提高藍(lán)藻的生態(tài)競爭優(yōu)勢的重要途徑之一。因此，藍(lán)藻對(duì)不同的環(huán)境因子產(chǎn)生特異 性應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，并嘗試?yán)盟{(lán)藻細(xì)胞對(duì)重要的環(huán)境因子產(chǎn)生特異 性的應(yīng)答反應(yīng)的生物學(xué)特性監(jiān)測藍(lán)藻水華發(fā)生。 憐是藍(lán)藻細(xì)胞膜與細(xì)胞核核酸的主要組成成分，同時(shí)又是細(xì)胞中高能化合物ATP、 ADP的基本組成元素，在能量傳遞和轉(zhuǎn)化中起著重要作用。水體中憐通常是藍(lán)藻生長的限制 性營養(yǎng)成分。在憐饑餓條件下，為滿足自身生命活動(dòng)對(duì)憐的需求，機(jī)體會(huì)增加憐的吸收，在 分子水平上，無機(jī)憐饑餓脅迫將誘導(dǎo)憐饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)，運(yùn)些基因包括一系列參與轉(zhuǎn) 運(yùn)Pi、含憐復(fù)合物的蛋白基因W及參與憐代謝的蛋白基因，如憐酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因PStl和 堿性憐酸酶基因地oA-1化e。 由于水體中的憐元素可WW各種有機(jī)或無機(jī)，溶解或顆粒物的形式出現(xiàn)，所W測 定水體生物有效態(tài)的憐對(duì)水質(zhì)富營養(yǎng)化程度監(jiān)測和藻華爆發(fā)預(yù)警有重要意義。傳統(tǒng)上許多 國家往往從化學(xué)分析的角度評(píng)估水質(zhì)和水生態(tài)健康狀況。化學(xué)分析方法通過復(fù)雜的儀器設(shè) 備理論上可W快速而靈敏地監(jiān)測任何化學(xué)物質(zhì)，但是運(yùn)些儀器分析技術(shù)并不能測定化合物 的生物危害和生物有效性。采用生物檢測技術(shù)具有多方面的優(yōu)勢：首先生物檢測技術(shù)可W 提供污染的前期預(yù)警，從而采取補(bǔ)救措施避免污染；此外，生物方法還可W幫助評(píng)估化合物 在復(fù)合污染情況下的生物效應(yīng)。目前國際上尚沒有利用生物方法檢測生物有效憐的相關(guān)專利，不過國外已經(jīng)有人 采用基于堿性憐酸酶的方法來評(píng)估水體中的生物有效憐。堿性憐酸酶是一類可W將水中含 憐的有機(jī)分子水解并釋放出可W吸收形態(tài)憐的胞外酶，基于堿性憐酸酶的憐含量測定方法 是利用紫外分光光度法通過測定堿性憐酸酶的酶活性來確定憐含量，運(yùn)種方法有效但是相 對(duì)繁瑣而且費(fèi)時(shí)。因此，通過對(duì)本±藻類物種的生長過程進(jìn)行研究，開發(fā)基于憐代謝相關(guān)酶 基因相對(duì)表達(dá)量獲得水體生物有效憐含量的測定方法，利用本±藻類物種從分子生物學(xué)水 平對(duì)水體生物有效憐含量進(jìn)行測定，將為我國環(huán)境監(jiān)測和管理部口在水體富營養(yǎng)化監(jiān)測與 水華爆發(fā)預(yù)警等領(lǐng)域的科技應(yīng)用和技術(shù)提升提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題 為了解決目前國際上尚沒有很好地利用生物方法檢測生物有效憐的相關(guān)專利，而 且已有的基于堿性憐酸酶活性測定的方法來評(píng)估水體中的生物有效憐相對(duì)繁瑣而費(fèi)時(shí)的 問題，本專利技術(shù)提供了一種通過檢測本±藻類物種魚腥藻FACHB-1299憐代謝相關(guān)酶基因表 達(dá)量來獲得水體生物有效憐含量的分子生物學(xué)測定方法。[000引 2、技術(shù)方案 為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是： 一種檢測魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的引物，為W下兩對(duì)引物中的一對(duì)或兩 對(duì)，其中一對(duì)引物用于檢測憐酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因pstl，該引物的上游序列如序列表SeqID No. 1所示，下游序列如序列表SeqIDNo. 2所示，PStl基因的DNA序列如序列表SeqID No. 5所示；另一對(duì)引物用于檢測堿性憐酸酶基因地oA-1化e，該引物的上游序列如序列表 SeqIDNo. 3所示，下游序列如序列表SeqIDNo. 4所示，phoA-like基因的DNA序列如序 列表SeqIDNo.6所示； 本專利技術(shù)還提供了該檢測魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的引物的應(yīng)用，該引物可 W用于測定水體生物的有效憐含量，測得的水體生物有效憐含量可用于監(jiān)測水質(zhì)富營養(yǎng)化 程度從而加強(qiáng)藻華爆發(fā)預(yù)警。 本專利技術(shù)還提供了一種通過檢測魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來測定水體生物 有效憐含量的方法，具體包括如下步驟： 步驟一：培養(yǎng)在環(huán)境樣品中生長，并在0. 05,0. 25,0. 5,1，2mg/L五個(gè)不同憐濃度 梯度下馴化的魚腥藻，；[001引步驟二：提取魚腥藻樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA; 步驟S:將步驟二所得CDNA梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)模板，W引物為引導(dǎo)進(jìn)行實(shí)時(shí)巧 光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置闊值； 步驟四：W待測環(huán)境樣品的CDNA為模板，對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增， 獲得相應(yīng)的Ct值，計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)量2&AU,用于后續(xù)待檢測水體生物樣品CDNA濃度 的校正； 步驟五：利用引物與步驟四同時(shí)對(duì)待檢測環(huán)境樣品的CDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果確定環(huán)境樣品對(duì)應(yīng)的Ct值； 步驟六：W2 法計(jì)算憐代謝相關(guān)酶基因的相對(duì)表達(dá)量，憐濃度W2為底數(shù)取對(duì) 數(shù)值作為X，憐代謝相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量W10為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為y，作xy曲線圖，并畫 對(duì)數(shù)趨勢線，獲得對(duì)數(shù)趨勢線公式及R值； 步驟屯：將環(huán)境樣品的憐代謝相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量W 10為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為y 代入公式，獲得X，W2為底數(shù)取指數(shù)值得到環(huán)境樣品中生物有效憐含量。 進(jìn)一步地，通過檢測魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來測定水體生物有效憐含量 的方法中的引物為用于檢測憐酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因PStl的引物和/或用于檢測堿性憐酸酶 基因地oA-1化e的引物。進(jìn)一步地，通過檢測魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來測定水體生物有效憐含量 的方法步驟四中的內(nèi)參基因?yàn)?6S，擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物序列如序列表SeqIDNo.7-8所 示： 進(jìn)一步地，通過檢測魚腥藻憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來測定水體生物有效憐含量 的方法步驟一中的不同憐濃度梯度為0. 05,0. 25,0. 5,l，2mg/L五個(gè)梯度。 本專利技術(shù)還提供了一種通過檢測魚腥藻的憐代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量來測定水體生 物有效憐含量的試劑盒，包括檢測用引物、巧光定量PCR混合液，其特征在于，所述引物包 括： 進(jìn)一步地，本專利技術(shù)試劑盒的反應(yīng)是在Applied Biosybkn-柄！St巧化e實(shí)時(shí)巧光定 量PCR儀上進(jìn)行的；反應(yīng)體系為：2 XMaster Mix IOy L含有化g/y L魚腥藻cDNA模板 2 y L 0. 2mmol/L引物0. 4 y L加滅菌超純水至20 y L ;實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序 為：95°C 15s，60°C Imin,再從65°C連續(xù)升溫至95°C，每升高0. 3°C收集巧光1次，最后降溫 至40°C ;最后，在AppliedBiosyste!化、皮的Step One Software軟件中2. Ivision自動(dòng)生成 擴(kuò)增產(chǎn)物的烙解曲線。 3、有益效果 (1)本專利技術(shù)采用生物檢測技術(shù)可W提供污染的前期預(yù)警，從而采取補(bǔ)救措施避免 污染； (2)本專利技術(shù)所采用的生物檢測技術(shù)可W幫助評(píng)估化合物在復(fù)合污染情況下的生物 效應(yīng)； (3)本專利技術(shù)的技術(shù)可W測定水體中生物有效態(tài)的憐，通過水體生物有效憐含量來 監(jiān)測水質(zhì)富營養(yǎng)化程度，運(yùn)對(duì)藻華爆發(fā)預(yù)警有重要意義。【附圖說明】 圖1為憐濃度W 2為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為x，pstl基因相對(duì)表達(dá)量W 10為底數(shù)取對(duì) 數(shù)值作為y的對(duì)數(shù)趨勢線。 圖2為憐濃度W 2為底數(shù)取對(duì)數(shù)值作為X，phoA-like本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測魚腥藻磷代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量的引物，其特征在于，所述引物為以下兩對(duì)引物中的一對(duì)或兩對(duì)，其中一對(duì)引物用于檢測磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因pstl，所述引物的上游序列如序列表Seq?ID?No.1所示，下游序列如序列表Seq?ID?No.2所示，pstl基因的DNA序列如序列表Seq?ID?No.5所示；另一對(duì)引物用于檢測堿性磷酸酶基因phoA?like，所述引物的上游序列如序列表Seq?ID?No.3所示，下游序列如序列表Seq?ID?No.4所示，phoA?like基因的DNA序列如序列表Seq?ID?No.6所示；Seq?ID?No.1：pstl?F：GCCACAGCTCAAGCTCAAAC；Seq?ID?No.2：pstl?R：CCCACCACCACTACCAATCC；Seq?ID?No.3：phoAlike?F：GTGGCTGGAGCAAGAACTTA；Seq?ID?No.4：phoAlike?R：CAGCATCTTGAGGGTTGTGT。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張效偉，楊雅楠，夏普，
申請(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32