一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒及其檢測方法技術

本發明專利技術屬于微生物分子檢測領域，尤其涉及一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒及其檢測方法。本發明專利技術提供的軍團菌快速檢測與分型試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液、PCR反應液、PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液,所述PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液含有軍團菌屬特異引物和嗜肺軍團菌16s?rRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物。本發明專利技術提供的試劑盒具有特異性強和準確性高的優點，該試劑盒可以一步快速檢測出是否含有軍團菌，同時還可以鑒別出軍團菌是嗜肺軍團菌還是非嗜肺軍團菌，無需進行多次凝膠電泳分析，節省成本，操作簡便，而且檢測結果準確，是一種理想的軍團菌快速檢測與分型的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒及其檢測方法
本專利技術屬于微生物分子檢測領域，尤其涉及一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
軍團菌是一種胞內寄生的革蘭陰性桿菌，在土壤和水系統中廣泛存在。目前軍團菌屬有52種包括70多個血清型，并不斷有新的菌種從環境中分離。近年來發現，約有一半的軍團菌種與人類疾病有關，其中80%以上的軍團菌感染是由嗜肺軍團菌引起。軍團菌通過空氣以氣溶膠的形式感染人，引起軍團菌性肺炎，嚴重威脅人類的健康。因此，建立一種能檢測軍團菌和快速鑒別嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌的方法具有重要的臨床意義。目前對軍團菌的檢測鑒定方法主要有血清抗體檢測、尿可溶性抗原檢測、軍團菌分離培養等。但是上述的檢測方法存在檢測時間長、陽性率低、培養基的配置復雜和價格昂貴的缺陷，不利于軍團菌的快速檢測。近年來，分子生物學的發展為微生物的分類鑒定工作提供了較簡便和準確的方法。PCR方法具有很高的特異性與敏感性，其主要是通過檢測軍團菌中的特異基因，以達到快速檢測軍團菌的目的。中國專利CN102071247B公開了一種區分非嗜肺與嗜肺軍團菌的檢測方法及試劑盒，所述的試劑盒組分包括核酸提取液、PCR緩沖液、熒光探針、Taq酶、內參照、陰性及陽性對照，其檢測的原理是采用特異性靶序列并根據此設計引物探針并通過熒光PCR擴增，以不同熒光標志的探針實時檢測同一靶序列而檢測軍團菌，并區分非嗜肺與嗜肺軍團菌。該檢測試劑盒操作簡便，可以避免自身PCR產物核酸污染產生的假陽性，而且能解決因樣本中PCR抑制劑引起的假陰性的問題。但是，該檢測試劑盒對樣品要求高，而且檢測結果判斷復雜，檢測結果準確性較低，不利于該試劑盒的推廣和應用。中國專利CN101597647B公開了一種軍團菌快速檢測試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括細菌組DNA提取液、PCR反應液、PCR產物純化液和酶切反應液。該試劑盒的是通過應用第一PCR反應液擴增后，以前一步PCR反應產物為模板，用第二PCR反應液擴增，將所得的最終PCR產物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產物混合后加入到PCR純化柱內，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產物；將PCR純化產物加入到酶切反應液中消化，將酶切產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測。該試劑盒具有靈敏度高和特異性高的優點。但是，該試劑盒檢測步驟較多，操作繁瑣，大大的限制了該試劑盒的應用。因此，研究和開發出一種操作簡單、檢測結果便于判斷、檢測結果準確性高的軍團菌試劑盒是當前亟需解決的難題。
技術實現思路
為解決現有技術中軍團菌試劑盒存在操作繁瑣、結果判斷復雜和檢測結果準確性低的缺陷，本專利技術提供一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒及其檢測方法，以解決上述問題。本專利技術提供一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液、PCR反應液、PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液,所述PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液含有軍團菌屬特異引物和嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物，所述軍團菌屬特異引物為：GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQIDNO.1)，GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’(SEQIDNO.2)；所述嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物為：LP-A628R：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’(SEQIDNO.3)，LP-C629F：5’-CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’(SEQIDNO.4)。進一步地，所述軍團菌屬特異引物和嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物的靶基因均為16srRNA基因。進一步地，所述細菌基因組DNA提取液的配方為：Chelex100resin5%；Tris-HCl10mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二鈉0.1mM；疊氮鈉0.1%；蛋白酶K200μg/ml。進一步地，所述PCR反應液為2×PCR反應液，所述2×PCR反應液的組分及其組分濃度為：0.1U/μlEasyTaqDNA聚合酶；500μMdNTP；20mMTris-HCl，pH8.3；100mMKCl；3mMMgCl2。進一步地，所述PCR引物混合液中軍團菌屬特異引物與嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物的濃度比為1-3：1-3，所述軍團菌屬特異引物與嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物的濃度比優選為2：1。進一步地，所述陽性對照液還含有嗜肺軍團菌基因組DNA，所述軍團菌基因組DNA核苷酸序列在NCBI基因庫上編號為NR_074231。另外，本專利技術還提供了一種軍團菌快速檢測與分型的檢測方法，包括如下步驟：S1應用細菌基因組DNA提取液提取待測標本中的細菌基因組DNA；S2以細菌基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的軍團菌屬特異引物和嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物進行PCR擴增；S3將陽性對照和陰性對照進行PCR擴增；S4將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。優選地，所述步驟S2中的PCR擴增反應條件包括：階段1：94℃3min；階段2：94℃20s；階段3：59℃20s；階段4：72℃25s；35個循環；階段5：72℃5min；在4℃保溫。優選地，所述步驟S2中軍團菌屬特異引物擴增序列為261bp。其中，GL261F-GL261R引物對擴增序列為軍團菌屬16SrDNA基因一段保守序列，具體序列如下：GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。優選地，所述步驟S2中肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物分別與軍團菌屬特異引物配對擴增261bp內的一段序列；GL261F-（LPA628R）引物對擴增片段為203bp；（LP-C629F）-GL261R引物對擴增序列為97bp。其中，GL261F-（LP-A628R）引物對擴增片段亦為軍團菌屬16SrDNA基因一段保守序列為上述261bp片段內的一段203bp序列，具體序列如下：GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC；（LP-C629F）-GL261R引物對擴增序列亦為軍團菌屬16本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒，其特征在于，包括細菌基因組DNA提取液、PCR反應液、PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液,所述PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液含有軍團菌屬特異引物和嗜肺軍團菌16s?rRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物，所述軍團菌屬特異引物為：GL261F：5’?GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC?3’，GL261R：5’?CGATCTCTACGCATTTCACCG?3’；所述嗜肺軍團菌16s?rRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物為：LP?A628R?：5’?GTCAACCAGTATTATCTGACCGT?3’，LP?C629F?：5’??CTGGGCTTAACCTGGGAC?3’。

【技術特征摘要】
1.一種軍團菌快速檢測與分型試劑盒，其特征在于，包括細菌基因組DNA提取液、PCR反應液、PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液,所述PCR引物混合液、陽性對照液和陰性對照液含有軍團菌屬特異引物和嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物，所述軍團菌屬特異引物為：GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’；所述嗜肺軍團菌16srRNA基因單核苷酸多態性位點特異引物為：LP-A628R：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’，LP-C629F：5’-CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’。2.如權利要求1所述的軍團菌快速檢測與分型試劑盒，其特征在于，所述細菌基因組DNA提取液的配方為：Chelex100resin...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱慶義，詹曉勇，胡朝暉，梁耀銘，
申請(專利權)人：廣州金域醫學檢驗中心有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44