本發明專利技術提供了一種基于CRISPR/Cas系統的多年生黑麥草的育種方法，將CRISPR/Cas基因組編輯技術應用在多年生黑麥草品種改良上，對木質素合成關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT進行基因定點敲除，篩選出純合以及轉化載體缺失的突變體，培育出木質素含量降低的多年生黑麥草的育種材料，對于牧草的育種研究和品種改良具有重要的意義。
【技術實現步驟摘要】
【專利說明】-種基于CRISPR/Cas系統的多年生黑麥草的育種方法 所屬
本專利技術設及植物基因工程
，尤其設及一種基于CRISPR/Cas系統的多年 生黑麥草的育種方法。
技術介紹
黑麥草是世界上最重要的溫帶牧草之一，優良的黑麥草品種對于改善動物的營養 均衡、提高牛奶的產量和品質、增大乳品行業的利益，乃至改良人工草坪、防風固沙、保持水 ±、改善人類生存環境等都具有重要作用。黑麥草生長快、分葉多、能耐牧，是優質的放牧用 牧草，也是禾本科牧草中可消化物質產量最高的牧草之一。黑麥草營養價值高，富含蛋白 質、礦物質和維生素，其中干草粗蛋白含量高達25%W上，且葉多質嫩，適口性好，可直接喂 養牛、羊、馬、兔、鹿、豬、碟、駝鳥、魚等。傳統雜交育種存在種質資源豐富度的硬性要求和遠 緣不親和的技術瓶頸，如何通過新興的生物技術獲得黑麥草重大、突破性品種，成為黑麥草 育種研究的突破口和關鍵技術。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中存在的上述問題，提供一種基于CRISPR/Cas系 統的多年生黑麥草的育種方法，得到木質素含量降低的多年生黑麥草的育種材料。 陽004] 本專利技術的技術方案為： 陽0化]，其特征在于：包括下列步 驟： (1)、篩選功能基因，所述功能基因為木質素合成的關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT; 似、優化釀脈鏈球菌化s9基因，并在基因編碼序列的兩端分別添加化S核定位信 號和限制性內切酶位點；[000引 （3)、用限制性內切酶酶切優化的化s9基因，得到基因片段，連入載體，得到重組 質粒pA; (4)、擴增多年生黑麥草的U3或U6RNA啟動子，連接在曲NA骨架序列前，將U3或 U6啟動子和曲NA構建在地載體上； 巧）、設計并合成帶有粘性末端的祀位點引物，連接于地載體上； 化）、W黑麥草幼苗為起始材料，采用纖維素酶R-IO和離析酶R-10,對黑麥草葉肉 組織進行消化并利用密度梯度沉降的方法分離原生質體，獲得高純度的原生質體； 陽01引 （7)、通過PEG介導法將目的基因導入黑麥草原生質體基因組中，通過后續原生質 體基因組DNA提取，進行酶切和測序，檢測構建載體pA、PB的活性。 (8)、選擇高表達的祀位點引物進行遺傳轉化，在TO代轉基因植株中篩選功能基 因敲除的突變體； 巧）、在后代中篩選純合突變體W及pA、地質粒整合位點和祀基因位點不在同一 染色體上的品系；(10)、將步驟（9)篩選得到的純合突變體和所述品系進行回交轉育，得到木質素 含量降低的多年生黑麥草品系； 本專利技術將CRISPR/Cas基因組編輯技術應用在多年生黑麥草品種改良上，對木質 素合成關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT進行基因定點敲除，篩選出純合W及轉化載體缺失的突 變體，培育出木質素含量降低的多年生黑麥草的育種材料，對于牧草的育種研究和品種改 良具有重要的意義?！揪唧w實施方式】 下面結合實施例對本專利技術做進一步說明： 本專利技術提供的基于CRISPR/Cas系統的多年生黑麥草的育種方法，包括W下步驟：(1)、篩選功能基因，所述功能基因為木質素合成的關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT ; (2)、優化釀脈鏈球菌化s9基因，并在基因編碼序列的兩端分別添加化S核定位信 號和限制性內切酶位點；[OOW (3)、用限制性內切酶酶切優化的化s9基因，得到基因片段，連入載體，得到重組 質粒pA; 陽02引 （4)、擴增多年生黑麥草的U3或U6RNA啟動子，連接在曲NA骨架序列前，將U3或 U6啟動子和曲NA構建在地載體上；[002引妨、設計并合成帶有粘性末端的祀位點引物，連接于地載體上； 化）、W黑麥草幼苗為起始材料，采用纖維素酶R-IO和離析酶R-10,對黑麥草葉肉 組織進行消化并利用密度梯度沉降的方法分離原生質體，獲得高純度的原生質體；(7)、通過PEG介導法將目的基因導入黑麥草原生質體基因組中，通過后續原生質 體基因組DNA提取，進行酶切和測序，檢測構建載體pA、PB的活性。 (8)、選擇高表達的祀位點引物進行遺傳轉化，在TO代轉基因植株中篩選功能基 因敲除的突變體； 巧）、在后代中篩選純合突變體W及pA、地質粒整合位點和祀基因位點不在同一 染色體上的品系；[002引 （10)、將步驟（9)篩選得到的純合突變體和所述品系進行回交轉育，得到木質素 含量降低的多年生黑麥草品系；采用本專利技術的育種方法獲得的木質素含量降低的多年生黑麥草種子產品與丹麥 DLF-Tri化IiumA/S公司產品"凱力"相比，具有如下優勢：W上通過實施例對本專利技術的進行了詳細說明，但所述內容僅為本專利技術的較佳實施 例，不能被認為用于限定本專利技術的實施范圍。凡依本專利技術申請范圍所作的均等變化與改進 等，均應仍歸屬于本專利技術的專利涵蓋范圍之內?！局鳈囗棥?. ，其特征在于：包括下列步 驟： ⑴、篩選功能基因，所述功能基因為木質素合成的關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT; (2) 、優化釀膿鏈球菌Cas9基因，并在基因編碼序列的兩端分別添加NLS核定位信號和 限制性內切酶位點； (3) 、用限制性內切酶酶切優化的Cas9基因，得到基因片段，連入載體，得到重組質粒 pA； (4) 、擴增多年生黑麥草的U3或U6RNA啟動子，連接在gRNA骨架序列前，將U3或U6啟 動子和gRNA構建在pB載體上； (5) 、設計并合成帶有粘性末端的靶位點引物，連接于pB載體上； (6) 、以黑麥草幼苗為起始材料，采用纖維素酶R-IO和離析酶R-10,對黑麥草葉肉組織 進行消化并利用密度梯度沉降的方法分離原生質體，獲得高純度的原生質體； (7) 、通過PEG介導法將目的基因導入黑麥草原生質體基因組中，通過后續原生質體基 因組DNA提取，進行酶切和測序，檢測構建載體pA、pB的活性。 (8) 、選擇高表達的靶位點引物進行遺傳轉化，在TO代轉基因植株中篩選功能基因敲 除的突變體； (9) 、在后代中篩選純合突變體以及pA、pB質粒整合位點和靶基因位點不在同一染色 體上的品系； (10) 、將步驟（9)篩選得到的純合突變體和所述品系進行回交轉育，得到木質素含量 降低的多年生黑麥草品系?！緦＠勘緦＠夹g提供了，將CRISPR/Cas基因組編輯技術應用在多年生黑麥草品種改良上，對木質素合成關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT進行基因定點敲除，篩選出純合以及轉化載體缺失的突變體，培育出木質素含量降低的多年生黑麥草的育種材料，對于牧草的育種研究和品種改良具有重要的意義?！綢PC分類】A01H5/00, C12N15/87, C12N15/82【公開號】CN105219799【申請號】CN201510695643【專利技術人】高崑 【申請人】天津吉諾沃生物科技有限公司【公開日】2016年1月6日【申請日】2015年10月22日本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于CRISPR/Cas系統的多年生黑麥草的育種方法，其特征在于：包括下列步驟：(1)、篩選功能基因，所述功能基因為木質素合成的關鍵酶基因LpCCR和LpCOMT；(2)、優化釀膿鏈球菌Cas9基因，并在基因編碼序列的兩端分別添加NLS核定位信號和限制性內切酶位點；(3)、用限制性內切酶酶切優化的Cas9基因，得到基因片段，連入載體，得到重組質粒pA；(4)、擴增多年生黑麥草的U3或U6RNA啟動子，連接在gRNA骨架序列前，將U3或U6啟動子和gRNA構建在pB載體上；(5)、設計并合成帶有粘性末端的靶位點引物，連接于pB載體上；(6)、以黑麥草幼苗為起始材料，采用纖維素酶R?10和離析酶R?10，對黑麥草葉肉組織進行消化并利用密度梯度沉降的方法分離原生質體，獲得高純度的原生質體；(7)、通過PEG介導法將目的基因導入黑麥草原生質體基因組中，通過后續原生質體基因組DNA提取，進行酶切和測序，檢測構建載體pA、pB的活性。(8)、選擇高表達的靶位點引物進行遺傳轉化，在T0代轉基因植株中篩選功能基因敲除的突變體；(9)、在后代中篩選純合突變體以及pA、pB質粒整合位點和靶基因位點不在同一染色體上的品系；(10)、將步驟(9)篩選得到的純合突變體和所述品系進行回交轉育，得到木質素含量降低的多年生黑麥草品系。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：高崑，
申請(專利權)人：天津吉諾沃生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12
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