一種用于激活胃癌特異性免疫反應的試劑盒制造技術

本發明專利技術提供了一種用于激活胃癌特異性免疫反應的試劑盒，包括有RPMI-1640培養基、細胞培養上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及胃癌特異性抗原多肽組合；所述細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清或者T細胞培養上清；所述胃癌特異性抗原多肽組合為MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、NY-ESO-1-A2、PLAC1-A2、CEA-A2、CEA-A3、hTERT-A2、hTERT-A3、HER2-A2、Survivin-A2及Survivin-A抗原多肽；本發明專利技術的試劑盒可以高效地以主動誘導/被動誘導相結合的方式激活胃癌病人特異性的免疫反應。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種增強抗癌免疫的試劑盒，尤其涉及一種用于激活胃癌特異性免疫反應的試劑盒。
技術介紹
胃癌在我國各種惡性腫瘤中居首位，危害極大。自進入二十一世紀以來，分子生物學與免疫學的長足進步為臨床腫瘤治療提供了新的策略。通過分子生物學的手段已鑒定出大量的腫瘤細胞特異性的抗原，并通過生物信息學的手段分析出其被免疫細胞識別的位點，這為重建患者的腫瘤特異性免疫反應帶來的可能。但是最近十年以來的一系列臨床試驗結果顯示，以腫瘤特異性抗原肽為基礎的腫瘤疫苗的臨床效果令人失望，其中一個重要的原因是抗原提呈過程的缺陷。XiZhao等人用慢病毒感染的DC細胞使其持續性高表達外源性IL12，發現DC.IL12細胞能夠高效的誘導抗原特異性CTL細胞的產生，將DC.IL12與腫瘤抗原肽回輸至小鼠體內可顯著性的縮小腫瘤腫塊。感染空載病毒的DC細胞并不能有效的激發相應的免疫反應，回輸后對小鼠的腫瘤大小無顯著性的影響。該研究提示了高表達IL12的DC細胞對于腫瘤疫苗發揮其抗癌臨床作用的重要性。DC細胞是哺乳類動物體內具有抗原提呈能力的一類細胞，其主要功能是攝取、加工處理和遞呈抗原，激活或調節適應性免疫應答。T細胞因此被激活而生成MHC-I類限制性CD8陽性細胞毒性T細胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ類限制性的CD4陽性的一型T輔助細胞(type1Thelper,Th1)。一型極化樹突狀細胞(Type1PolarizedDendriticcell,DC1)是成熟DC細胞的一類亞群，具有強有力的免疫激活能力。DC1細胞的重要的特征是高表達IL12p70以及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特異性的CD8+T細胞和CD4+Th1細胞相關的免疫反應。RobbieB.Mailliard等證實了DC1體外誘導黑色素瘤抗原特異性的CTL細胞的能力可達到正常的成熟DC細胞的40倍以上。AdrianaTLarregina等人還發現DC1細胞誘導B16黑色素瘤抗原特異性CD4+輔助性T細胞，并且促進CD4+輔助性T細胞對腫瘤組織的浸潤。因此，高表達IL12的DC1細胞負載腫瘤特異性抗原肽可以為增強抗原肽為基礎的腫瘤治療療效提供了一種策略，但現有技術中還沒有能夠相應的、成熟的并適用于激活胃癌病人特異性免疫反應的試劑盒。
技術實現思路
本專利技術為解決現有技術中的上述問題提出一種試劑盒用于胃癌的臨床治療。體外誘導腫瘤患者自體的DC細胞，獲得富集DC1細胞的產物；DC1細胞負載腫瘤特異性肽段組合，可以用于體外或體內的腫瘤抗原特異性的細胞毒性T細胞的誘導。為了解決上述技術問題，本專利技術所提供的技術措施為：本專利技術提供了一種用于激活胃癌特異性免疫反應的試劑盒，包括有RPMI-1640培養基、細胞培養上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及胃癌特異性抗原多肽組合；其中，所述細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清或者T細胞培養上清；所述胃癌特異性抗原多肽組合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、NY-ESO-1-A2、PLAC1-A2、CEA-A2、CEA-A3、hTERT-A2、hTERT-A3、HER2-A2、Survivin-A2及Survivin-A3抗原多肽，其多肽序列分別如SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.7，SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11及SEQIDNo.12所示。為了進一步優化上述技術方案，本專利技術所采取的技術措施還包括：優選地，NK細胞與K562細胞共培養上清通過將K562細胞與NK細胞按1:2至1:10比例共培養并加入IFNα，24小時后收集培養基上清而獲得。優選地，所述T細胞培養上清的制備過程中，首先分離外周血單核細胞，淋巴細胞分離液分理單個核細胞，用CD8磁珠分選出CD8+T細胞后，接種至培養基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培養基，48h后收集T細胞培養上清。優選地，利用試劑盒激活胃癌病人腫瘤特異性免疫反應包括以下步驟：步驟一，分離病人外周血中的單核細胞，細胞短暫貼壁培養之后，移除懸浮細胞，加入誘導劑GM-CSF和IL-4培養兩天，培養第3天，第5天更換一半量的培養基，并加入胃癌特異性抗原多肽組合，獲得負載有胃癌特異性抗原多肽組合的成熟DC細胞；步驟二，將所述步驟一中制得的成熟DC細胞用INFγ以及所述的NK細胞與K562細胞共培養上清進一步培養誘導兩天，使所述的成熟DC細胞分化為DC1細胞；步驟三，利用步驟二所獲得的DC1細胞進行體內主動誘導和/或體外被動誘導。優選地，所述NK細胞來源于人類臍帶血。優選地，所述T細胞培養上清為利用自體或異體T細胞獲得。優選地，所述步驟三中的體內主動誘導過程為將所述步驟二所獲得的DC1細胞回輸到病人體內。優選地，所述步驟三中的體外被動誘導過程為將所述步驟二所獲得的DC1細胞與T細胞混合培養，并再次負載胃癌特異性抗原多肽，然后收集細胞，回輸到病人體內。優選地，試劑盒還可以包括GGT551培養基、DMEM/F12培養基或DMEM培養基。本專利技術采用上述技術方案，與現有技術相比，本專利技術的技術效果體現在以下幾個方面：首先，本專利技術提供了一組用于胃癌免疫治療的特異性抗原多肽組合，該組合包含了多種胃癌細胞的特異性表達抗原的肽段。這些肽段包括了HLA-A2與A3呈遞的序列區域，覆蓋了80％以上的已報道的胃癌細胞特異性抗原。因此，我們提供了一種新的胃癌特異性抗原多肽組合，有利于激活罹患胃癌病人的針對腫瘤細胞的獲得性免疫反應。其次，本專利技術還提供了一種利用本專利技術的試劑盒，體外制備成熟DC1細胞，用于負載胃癌細胞特異性抗原組合的方法。與常用誘導方案相比，利用本專利技術試劑盒所制備的產物中擁有成熟表型的DC細胞含量顯著性提高(如CD80，CD86，CD40L等表面抗原高表達)；經過sCD40L刺激之后，DC1細胞IL12P70表達量大大高于通用方案制備細胞的表達量。由此可見，本專利技術提供了一個更有效成熟DC1細胞制備方案，所得細胞產物可以用于胃癌細胞特異性抗原負載。最后，本專利技術提供了一種用于胃癌治療的DC1負載抗原肽的臨床應用方案。DC1細胞負載腫瘤特異性抗原之后，一部分細胞回輸至患者體內，另一部分用于體外腫瘤抗原特異性本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于激活胃癌特異性免疫反應的試劑盒，其特征在于，包括有RPMI?1640培養基、細胞培養上清、GM?CSF、IL?4、INFγ以及胃癌特異性抗原多肽組合；其中，所述細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清或者T細胞培養上清；所述胃癌特異性抗原多肽組合為序列如SEQ?ID?No.1，SEQ?ID?No.2，SEQ?ID?No.3，SEQ?ID?No.4，SEQ?ID?No.5，SEQ?ID?No.6，SEQ?ID?No.7，SEQ?ID?No.8，SEQ?ID?No.9，SEQ?ID?No.10，SEQ?ID?No.11及SEQ?ID?No.12的多肽組合。

【技術特征摘要】
1.一種用于激活胃癌特異性免疫反應的試劑盒，其特征在于，包括有
RPMI-1640培養基、細胞培養上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及胃癌特異性抗
原多肽組合；其中，所述細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清或者
T細胞培養上清；所述胃癌特異性抗原多肽組合為序列如SEQIDNo.1，SEQID
No.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.7，
SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11及SEQIDNo.12
的多肽組合。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述NK細胞與K562細胞共
培養上清通過將K562細胞與NK細胞按1:2至1:10比例共培養并加入IFNα，
24小時后收集培養基上清而獲得。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述T細胞培養上清的制備過
程中，首先分離外周血單核細胞，淋巴細胞分離液分理單個核細胞，用CD8磁
珠分選出CD8+T細胞后，接種至培養基中，加入CD3CD28Beads，24h后加
入等量培養基，48h后收集T細胞培養上清。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，利用試劑盒激活胃癌病人腫瘤
特異性免疫反應包括以下步驟...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李偉，葉圣勤，汪鑫，瞿蘇，
申請(專利權)人：上海隆耀生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31