一種放線菌纖溶酶的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種放線菌纖溶酶的制備方法，所述方法的具體步驟如下：（1）向含有放線菌纖溶酶的發酵上清液中加入硫酸銨粉末，使其飽和度為25％-35%W/V，4℃放置過夜后，進行離心得到上清液，再向該上清液中加入硫酸銨粉末，使其飽和度為55-65%W/V，4℃放置過夜后，進行離心得到沉淀，用PB緩沖液將沉淀溶解，得到粗酶液；（2）將步驟（1）得到的粗酶液進行低溫離心除雜質，得到的上清液依次通過Octyl-Sepharose?FF疏水相互作用層析和Phenyl-Sepharose?HP疏水相互作用層析純化，得到色譜純的酶，經透析除鹽后冷凍干燥制得纖溶酶凍干粉，放入-20℃條件下可長期保存。本發明專利技術的放線菌纖溶酶的分離純化方法具有操作步驟簡單、回收率高的優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術設及，屬于生物

技術介紹
血栓栓塞類疾病嚴重危害人類生命和健康，溶栓法目前是治療和預防血栓性疾病 的主要手段，研制高效、快速、防止再栓塞并能降低出血等不良反應的新型溶栓藥物是現代 醫學的迫切需要。纖溶酶具有溶解血纖維蛋白的功能，血纖維蛋白是構成血栓的主要成分。利用微 生物發酵生產纖溶酶具有生產周期短，占地面積小，產物含量高等優點。因此，研制高效、特 異性強的微生物纖溶酶是生產新型溶栓藥物的主要方式。 本申請人一直在探索微生物在現代生物溶栓劑制備中的應用潛力，分別于2006 年、2010年成功地培制出了專利申請號為200610163497. 6和200810137564. 4的兩種微 生物纖溶酶，運兩種纖溶酶培養所使用的菌種都是真菌，真菌發酵代謝產物較多，導致纖溶 酶的后續分離純化步驟較多，過多的分離純化步驟會降低纖溶酶的活力，導致纖溶效果下 降，因此，多年來本申請人一直在努力尋找發酵代謝產物種類較少，易于產物分離純化的優 良產酶菌種。 陽0化]嗜酸放線菌UciobjO知7ic 曲八e沁S)廣泛分布于酸性環境中，可W產生耐 酸的胞外酶，如幾下質酶、蛋白酶、淀粉酶等，在酸性±壤有機物的降解循環中起著重要作 用。此外，由于大多數真菌適宜于酸性環境中生存，所W嗜酸放線菌也是極具潛力的抗真菌 活性物質的產生者。從嗜酸放線菌的代謝產物中開發新的天然生物活性物質，對新型藥物 的開發具有重要意義。放線菌YY21是一種中度嗜酸放線菌，在GYM和PDA培養基上可W產 生基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲分化成波曲狀抱子絲，抱子呈球形；菌株適宜的生長抑 范圍為3~7,可W向細胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，可W分解含硫氨基酸產生硫化氨，不能產生 纖維素酶；能夠利用葡萄糖和棉子糖作為碳源。在篩查放線菌YY21液體培養液的抑菌效果 時，發現培養液中含纖溶酶，申請人遂開始對放線菌YY21液體發酵產纖溶酶進行了深入研 究，本專利技術就是該項研究的部分內容。
技術實現思路
本專利技術的專利技術目的在于提供一種中度嗜酸放線菌纖溶酶的分離純化方法。本專利技術的具體步驟： 1、硫酸錠鹽析濃縮放線菌纖溶酶溶液：將放線菌YY21液體發酵產物在4°C條件下 100(K)r/min離屯、20min,得到上清液。經硫酸錠分級鹽析后得到粗酶液。 陽00引、Oct^-Se地arose FF疏水相互作用層析：向鹽析后得到的粗酶液中加入硫酸錠 粉末，充分溶解，使粗酶液中硫酸錠飽和度達到30%，經Oct^-Se地arose FF疏水相互作 用層析柱純化，用30- 0%W/V硫酸錠溶液梯度洗脫，收集有纖溶活性組分進行下一步的操 作； 3、Pheny；L-Se地aroseHP疏水相互作用層析：向經Octy]_-Se地aroseFF疏水相互作用 層析柱純化后收集的纖溶活性組分中加入硫酸錠粉末，使其硫酸錠飽和度達到15%，上樣 后用15 - 0%W/V硫酸錠溶液梯度洗脫，收集有纖溶活性組分進行下一步的操作； 4、 經過Se地adexG25凝膠過濾層析除去上一步纖溶活性收集液中的硫酸錠，經冷凍干 燥獲得纖溶酶凍干粉。 陽009] 本專利技術的優點： 1、原有的分離純化方法工藝路線長，樣品一般要經過=次甚至更多次柱層析才能達到 電泳純，分離時間較長、回收率較低而且操作過程繁瑣復雜。而本專利技術采用鹽析法濃縮發酵 液中纖溶酶，鹽析后無需脫鹽步驟，只需通過兩步疏水相互作用層析的分離純化便可得到 高純度纖溶酶，大大縮短了酶的純化流程，減少了酶活力的損失。該方法工藝過程簡單，分 離純化效率高，酶回收率較高。 、本專利技術所采用的純化方法使酶始終處于一定的硫酸錠飽和度中，有利于保護酶 的催化活力和穩定性。 、本專利技術W中度嗜酸放線菌為菌種生產纖溶酶，賦予了纖溶酶性質的特殊性，即在 偏酸性的環境中依然能夠保持穩定的活性，適宜開發為口服用藥。【附圖說明】 陽01引 圖1為SDS-PAGE法測定纖溶酶的純度圖片。 圖2為纖溶酶在血纖維蛋白平板上形成溶圈的圖片。 具體實施例 下面結合實施例對本專利技術作詳細說明，但本專利技術所保護范圍不限于此。 本專利技術所使用的放線菌菌株YY21已由本申請人于2012年2月27日向位于北 京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中屯、提供了菌種保藏，保藏號為CGMCCN。. 5816,其分類學命名為放線菌 Actinomycete sp.。 實施例中的凝血酶、纖維蛋白原、尿激酶標準品均購自sigma公司。 實施例1 1、斜面培養基：葡萄糖0. 4-0. 5%，酵母膏0. 3-0. 6%，麥芽浸膏0. 5-1. 5%，碳酸巧 0. 1-0. 2%，瓊脂 1. 5%，P冊.7。 斜面培養條件：28°C培養4-7d。、種子培養基：葡萄糖0. 4-0. 5%，酵母膏0. 3-0. 6%，麥芽浸膏0. 5-1. 5%，碳酸巧 0. 1-0. 2%，調節抑為6. 7,滅菌后備用。 培養條件：轉速為170-19化/min, 28°C震蕩培養28-3化，作為液體種子。、發酵培養基：小米粉6-8%，葡萄糖2-4%，碳酸巧0. 1-0. 3%，氯化鋼0. 4-0. 6%，蛋白 腺 0. 6-0. 7%，P冊.7, 5%接種量。 培養條件：150-170以111111，22°(：發酵90-10011。 將放線菌YY21液體發酵產物在4°C條件下1000化/min離屯、20min,得到上清液， 纖溶酶比活力為12.Olmg/mL。、放線菌纖溶酶粗酶液的制備：向含有放線菌纖溶酶的發酵上清液中加入硫酸錠 粉末，使其飽和度為25% -35%W/V，4°C放置IOh-I化后，進行離屯、得到上清液，再向該上清 液中加入硫酸錠粉末，使其飽和度為55-65%W/V，4°C放置10h-12h后，進行離屯、得到沉淀， 用PB緩沖液將沉淀溶解，得到粗酶液，此時纖溶酶比活力為22. 50mg/血。 陽〇2引實施例2 1、 斜面培養同實施例1 2、 種子培養同實施例1 3、 發酵培養同實施例1 4、 放線菌纖溶酶粗酶液的制備同實施例1 5、Oct^-Se地aroseFF疏水相互作用層析方法 向粗酶液中加入硫酸錠粉末，充分溶解，使其硫酸錠飽和度達到30%，上樣Oct^-Se地aroseFF疏水相互作用層析柱后用30- 0%W/V硫酸錠溶液梯度洗脫，收集有 纖溶活性組分，獲得纖溶酶比活力為112. 07mg/mL。 陽0%] 實施例3 1、 斜面培養同實施例1 2、 種子培養同實施例1 3、 發酵培養同實施例1 4、 放線菌纖溶酶粗酶液的制備同實施例1 5、Oct^-Se地aroseFF疏水相互作用層析方法同實施例2 6、Pheny；L-Se地aroseHP疏水相互作用層析方法 調節Oct^-Se地aroseFF疏水相互作用層析收集活性組分的硫酸錠飽和度到15%， 進行化en^-S巧haroseHP疏水相互作用層析，上樣后用15 - 0%W/V硫酸錠溶液梯度洗 脫，收集有纖溶活性組分進行，酶的比活力達到173. 1抓/mg,活力回收率19. 35%。實當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種放線菌纖溶酶的制備方法，該放線菌保藏號為CGMCC?No.5816，分類學命名為放線菌Actinomycetesp.，經液體發酵得到含纖溶酶的發酵液，經離心收集富含纖溶酶的上清液，依次采用硫酸銨分級鹽析、Octyl?Sepharose?FF疏水相互作用層析、Phenyl?Sepharose?HP疏水相互作用層析、透析除鹽、冷凍干燥制備得到纖溶酶凍干粉，經過Q?TOF2串聯質譜測得纖溶酶五個肽段的氨基酸序列分別為：A?Q?S?V?P?Y?G?L?S?Q?L?K，其分子量為1289.6644；V?A?V?L?D?S?G?L?D?S?S?H?P?D?L?K，其分子量為1651.8243；N?S?L?E?S?T?A?T?N?L?G?N?P?A?G?A?T?Y?G?K，其分子量為1964.8844；h?p?n?w?T?n?t?n?v?r，其分子量為1237.5844；Y?P?S?V?L?A?V?G?A?V?D?N?G?V?S?N?K，其分子量為1688.8043。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄧永平，劉曉蘭，鄭喜群，艾瑞波，
申請(專利權)人：齊齊哈爾大學，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23