一種大麗花脫毒苗的獲取方法技術

本發明專利技術公開了一種大麗花脫毒苗的獲取方法，其特征在于：該方法步驟如下：1）采集大麗花嫩葉，脫分化產生愈傷組織；2）將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗；3）進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織；4）再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗；5）隨機抽取步驟4）中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即大麗花脫毒種苗，若不合格需重復1）到4）步，直到獲得合格的大麗花脫毒種苗。本發明專利技術通過兩次脫分化產生愈傷組織并將愈傷熱處理后再分化，最終得到大麗花脫毒幼苗，解決了現有脫毒技術的脫毒不徹底、操作繁瑣的難題，能夠滿足工廠化脫毒生產的需要。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，具體涉及一種通過兩次脫分化產生愈傷組織并將愈傷組織熱處理后再分化、最終高效獲得大麗花脫毒幼苗的方法。
技術介紹
大_花(^3力^7<3 pinnata Cav)為菊科大_花屬多年生球根花奔，全屬約27種，又名大理菊、天竺牡丹、西番蓮、洋芍藥、大麗菊、地瓜花、紅苕花等，原產墨西哥、哥倫比亞及危地馬拉等國，后傳到歐洲、日本和我國。大麗花莖桿粗壯，葉片肥大，花形與牡丹相似，花大而色彩艷麗，具有花姿優美、花型多樣、花期長、品種繁多等特點，被譽為花卉中的寵兒。大麗花系天然種間雜交，人工選育的歷史不長，世界各國普遍栽培，目前在東北、西北、華北等地栽培較廣泛，其中在廣東秋、冬兩季栽培比較多。經過人工雜交選擇，成為異源八倍體，新品種層出不窮，花色嬌艷，花期長，適應性強，易于栽培，故一躍成為世界名花。目前大麗花是墨西哥的國花，西雅圖的市花，我國吉林省的省花，張家口、赤峰、包頭(小麗花)等城市的市花，大麗花象征大方、富麗，大吉大利，是世界著名的觀賞花卉。大麗花通常采用分根和扦插繁殖，但分根和扦插繁殖繁殖系數低，但每株每年僅可分出5-6個新株，無法滿足產業化生產的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代積累，從而造成大麗花品種退化嚴重。利用組織培養、離體快繁等技術進行莖尖脫毒培養，可以解決大麗花病毒病的問題。國內一些研究者采用大麗花外植體，進行了組織培養和脫毒技術的研究，獲得了一些研究進展，但是大麗花的組織培養和脫毒技術國內研究起步較晚，研究積累少，目前大麗花的脫毒技術還有待進步，脫毒效率低、操作繁瑣已經嚴重阻礙了大麗花品質的提高和生產的需求，因此對大麗花進行組織培養、離體快繁技術研究，建立并優化一種高效的脫毒苗培育技術，有重大的產業價值和廣闊的市場開發前景。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有大麗花脫毒技術存在的不足，提供一種可持續化、易操作且能夠規模化生產的高效獲得大麗花脫毒苗的方法，該方法解決了現有脫毒技術的脫毒不徹底、操作繁瑣的難題，能夠滿足工廠化脫毒生產的需要。本專利技術的目的是通過以下技術方案解決的: ，其特征在于:該方法步驟如下: 1)采集大麗花嫩葉，脫分化產生愈傷組織； 2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗； 3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織； 4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗；5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即大麗花脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的大麗花脫毒種苗。該方法的詳細步驟如下: 1)采集大麗花嫩葉，脫分化產生愈傷組織: 采集生長至現蕾期的健康無病的大麗花的嫩葉，自來水洗凈，流水沖洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞內加數滴吐溫-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒攪動，用無菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，用孔直徑5_的打孔器打孔，將打下的葉片接種到愈傷誘導培養基上25-27°C條件下暗培養，10-15天后產生淡黃綠色疏松的愈傷組織； 2)將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗: 將生長至大米粒大小、帶有少量外植體的愈傷組織轉移到培養箱中熱處理，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上25-27°C條件下光培養，20-30天后愈傷組織分化出不定芽，將再生出來的高度Icm以上的芽轉接至生根培養基培養成健壯的組培苗； 3)進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織: 待組培苗生長至5cm-8cm，剝取0.4-0.6cm大小的莖尖生長點接種到莖尖誘導愈傷培養基上，在25-27°C條件下暗培養30-45天，誘導出愈傷組織； 4)再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗: 再次將莖尖愈傷組織進行熱處理，切除褐化塊段后將愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上，25-27°C條件下光培養20-25天后誘導出不定芽，然后轉接入生根培養基，40-50天后可得到大麗花幼苗； 5)隨機抽取步驟4)中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即大麗花脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的大麗花脫毒種苗: 隨機抽取8-10只完成了步驟4)的的大麗花葉片，進行RT-PCR反轉錄病毒檢測，若檢測合格即大麗花脫毒種苗，若不合格需重復I)到4)步，直到獲得合格的大麗花脫毒種苗。步驟I)中用于誘導大麗花葉片產生愈傷組織的愈傷誘導培養基配方為:MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA +3% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。步驟2)中將將愈傷組織繼續誘導出不定芽的不定芽誘導培養基配方為:MS+2.5mg/L6-BA+0.08NAA+3%蔗糖+6.5g/L植物凝膠，pH為5.8 ;所述的將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養的光照條件均為:光照強度為1500-2000LUX，光周期為14h光/1h 暗。步驟2)和步驟4)中熱處理方法為:在38°C _42°C高溫處理6h-8h、然后26°C -28°C低溫處理10h-12h交替進行2-3循環。步驟3)中用于誘導莖尖產生愈傷組織的培養基配方為:MS+4.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+3% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。步驟4)中將愈傷組織誘導出不定芽的不定芽誘導培養基配方為:MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/L NAA +3% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8 ;生根培養基配方為:l/2MS+0.15mg/L NAA+1.5% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。步驟4)中將莖尖愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養的光照條件均為:光照強度為1500-2000LUX，光周期為12h光/12h暗。步驟5)病毒檢測的病毒種類為大麗花葉病毒、煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒。本專利技術所述的，是專利技術人經過仔細研究、大量實驗驗證后獲得的優選結果，相比現有技術，本專利技術的創新點為: 本專利技術通過采用綜合脫毒技術，即兩次愈傷組織誘導、愈傷組織熱處理脫毒、莖尖脫毒相結合的方法，有效的克服了脫毒材料較多、脫毒操作流程繁瑣、脫毒效率低下等難題，能夠高效獲得大麗花脫毒幼苗。本專利技術創造性的采用了愈傷組織熱處理的脫毒方法，采用本專利技術的愈傷組織熱處理后，切割掉褐化部分，培養熱處理后褐化程度不明顯的愈傷部分，可有效去除掉愈傷組織攜帶的病毒，大大提高了脫毒效率，而且避免了無菌操作，操作簡單。本專利技術的大麗花脫毒苗的獲取方法采用莖尖誘導成愈傷，提高了大麗花的種性，又進一步脫除了大麗花病毒，該方法流程簡單、容易操作，故易于形成規模化生產的脫毒種苗，適宜推廣使用。【附圖說明】圖1是大麗花脫分化產生愈傷組織的結果圖； 圖2是大麗花愈傷組織分化出不定芽的結果圖； 圖3是莖尖脫毒后生根培養后的大麗花幼苗結果圖； 圖4是大麗花脫毒前后幼苗性狀的對比結果圖。【具體實施方式】下面結合具體實施例和附圖對本專利技術作進一步的說明。，該方法的詳細步驟如下: 1)采集大麗花的嫩葉，脫分化產生愈傷組織:采集生長至現蕾期的健康無病的大麗花的嫩葉，自來水洗凈，流水沖洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞內加數滴本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種大麗花脫毒苗的獲取方法，其特征在于：該方法步驟如下：1）采集大麗花嫩葉，脫分化產生愈傷組織；2）將愈傷組織進行熱處理，然后將愈傷組織繼續誘導出不定芽、不定芽生根培養成健壯的組培苗；3）進一步剝離組培苗莖尖，脫分化產生愈傷組織；4）再次將愈傷組織進行熱處理后誘導成苗；5）隨機抽取步驟4）中的組培苗，進行病毒檢測，若檢測合格即大麗花脫毒種苗，若不合格需重復1）到4）步，直到獲得合格的大麗花脫毒種苗。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：宋立勝，
類型：發明
國別省市：山東;37